โครงสร้างของเซลล์โปรคาริโอตและหน้าที่

โครงสร้างของเซลล์โปรคาริโอตและหน้าที่ 
(Prokaryotic cell structure and function)

                ในโลกของสิ่งมีชีวิต  แบคทีเรียนั้นมีบทบาทที่สำคัญ เนื่องจากว่ามีแบคทีเรียจำนวนมากมายในโลกนี้   แบคทีเรียมีความสำคัญทางด้านสิ่งแวดล้อม  มีความสำคัญต่อมนุษย์ เป็นผู้สร้าง และเป็นผู้ย่อยสลาย         ถึงแม้ว่าความสนใจทางด้านวิทยาศาสตร์จะเน้นหนักไปในเรื่องของ eukaryotes        การศึกษาโปรคาริโอต (prokaryotes) ก็เป็นพื้นฐานที่สำคัญที่จะช่วยให้เข้าใจในระบบที่ซับซ้อนยิ่ง ๆ ขึ้นไปใน eukaryotes       โดยทั่วไป prokaryotes แบ่งได้เป็น bacteria และ archaea อย่างไรก็ตามในบทความนี้จะกล่าวถึง prokaryotic cells ซึ่งก็จะรวมทั้ง bacteria และ archaea เข้าด้วยกัน

1.      โครงสร้างของเซลล์โปรคาริโอต

ซึ่งในหัวข้อนี้จะกล่าวถึงองค์ประกอบของเซลล์ (cell components) เป็นหลัก

1.1   ขนาด (size) รูปร่าง (shape) และการเรียงตัว (arrangement)

ลักษณะทางสัณฐานวิทยา (morphology) ของโปรคาริโอต (procaryotes) แบ่งได้เป็น 6 แบบคือ

1.       Cocci (coccus) = a roughly spherical cell

2.       Diplococci (diplococcus) เกิดขึ้นเมื่อ coccus แบ่งตัวแต่เซลล์นั้นยังคงติดกันอยู่เป็นคู่   แบคทีเรียบางชนิดเมื่อแบ่งเซลล์ในระนาบเดียวแล้ว เซลล์ยังติดกันอยู่จนมองเห็นเป็นสาย (Streptococcus, Enterococcus และ Lactococcus) ในแบคทีเรีย Staphylococcus การแบ่งตัวเกิดขึ้นแบบสุ่ม (random) ไปทุกระนาบ  ทำให้เห็นกลุ่มเซลล์คล้ายพวกองุ่น (grape-like clump) Micrococcus มีการแบ่งเซลล์เป็น 2 ระนาบ ดังนั้นจึงเห็นเซลล์ลักษณะ 4 เซลล์เรียงติดกัน (tetrad) ในแบคทีเรีย Sarcina genus การแบ่งตัวของเซลล์มี 3 ระนาบ ทำให้ได้เซลล์ออกมาเป็น 8 เซลล์เรียงติดกัน

3.  Rod หรือ Bacillus ( bacilli) มีอัตราความกว้างกับความยาว แบคทีเรียบางชนิดเป็น coccobacilli (ลักษณะคล้าย cocci) บางชนิดเห็นเป็นแท่งยาวชัดเจน    Vibrio มีลักษณะของ bacilli ที่งอทำให้ดูคล้ายเครื่องหมาย comma

4.     Mycelium เป็นโครงสร้างที่เกิดจากพวกรา เช่น Actinomycetes เป็น filaments หรือ hyphae ที่เป็นเส้นยาวต่อกันโยงใยเป็น network

5.  Spirilla หรือ spirochetes โครงสร้างเป็นแท่งยาวขดเป็นเกลียว (spirals หรือ helices) ถ้าโครงสร้างแข็ง (rigid) เรียกเป็น spirilla ถ้าโครงสร้างนี้เคลื่อนได้เรียกว่า spirochetes

6. Pleomorphic โครงสร้างของแบคทีเรียที่เป็นได้หลายรูปแบบเช่น Corynebacterium    นอกจากนี้แล้ว แบคทีเรียยังมีขนาดต่างๆกันไปด้วย โดยมีขนาดเล็กตั้งแต่ 0.2mm x 0.05 mm (nanobacteria) ไปจนถึงเส้นผ่าศูนย์กลาง 600-800  mm (Thiomargarita namibiensis) ซึ่งมีขนาดใหญ่กว่าขนาดของเซลล์พืชและสัตว์ทั่วๆไป (เส้นผ่าศูนย์กลาง 10-50 mm) 

1.2 โครงสร้างของ procaryotic cells

องค์ประกอบและหน้าที่ต่าง ๆ ของโครงสร้างต่าง ๆ ของ procaryotic cells นั้น

procaryotic cells นั้นล้อมรอบด้วย cell wall ที่ซับซ้อน     ภายในเซลล์ยังมีผนังอักชั้นหนึ่งเป็น plasma membrane    และระหว่าง cell wall กับ palsma membrane จะมีช่องว่างเรียกว่า periplasmic space            ribosomes และองค์ประกอบที่มีมวลมาก ๆ (lerger masses) ของแบคทีเรียเรียกว่า inclusion bodies จะกระจัดกระจายอยู่ภายใน cytoplasm matrix ทั้ง gram-positive และ negative bacteria สามารถใช้ flagella ในการเคลื่อนที่ (locomotion)ได้     นอกจากนี้  แล้วเซลล์บางชนิดยังมีผนังชั้นหนาชั้นนอกเป็น capsule หรือ slime layer ล้อมรอบ cell wall ไว้อีกชั้นหนึ่งด้วย

2. Procaryotic cell membranes

membranes เป็นส่วนที่จำเป็นของสิ่งมีชีวิตทุกชนิด  เซลล์มีความจำเป็นที่จะต้องทำการปฏิสัมพันธ์กับ          สิ่งแวดล้อมรอบด้านด้วยรูปแบบที่แตกต่างกันไป  ขึ้นอยู่กับชนิดและวิวัฒนาการของสิ่งมีชีวิตนั้นๆ   นอกจากนี้แล้วเซลล์ยังจำเป็นต้องมีการจัดการกับการนำอาหารเข้ามาสู่ภายในเซลล์   การขับของเสียทิ้งออกจากเซลล์ และยังจำเป็นต้องคอยรักษาสมดุลภายในเซลล์เมื่อเจอกับสภาวะแวดล้อมที่ต่าง ๆ กันไปอีกด้วย       plasma membrane เป็นเนื้อเยื่อที่ห่อหุ้ม cytoplasm ทั้งใน prokaryotic และ eukaryotic cells เนื้อเยื่อนี้เป็นจุดที่สำคัญที่เซลล์ใช้ปฏิสัมพันธ์กับสิ่งแวดล้อม        ดังนั้นเพื่อที่จะเข้าใจหน้าที่ของเนื้อเยื่อต่าง ๆ เราจำเป็นต้องทำความเข้าใจถึงโครงสร้างของ membrane โดยเฉพาะกับ plasma membrane

2.1 The plasma membrane

membranes ประกอบด้วยทั้ง proteins, lipids และ  carbohydrates           membranes ของแบคทีเรียปกติจะมีอัตราส่วนของ protein มากกว่าของ  eucaryotic membrane           สมมติฐานได้ว่า bacterial membranes จำเป็นต้องทำหน้าที่หลาย ๆ อย่างให้กับแบคทีเรียจึงทำให้มีอัตราส่วนของ protein ที่ membrane มากกว่า membranes ต่าง ๆ ของ eucaryotes          โครงสร้างของ lipids ที่เป็นองค์ประกอบที่ membrane ส่วนมากจะมีทั้งปลายมีขั้ว (polar) และ ไม่มีขั้ว (nonpolar) เรียกว่า amphipathic       ปลายส่วนที่มีขั้วสามารถทำปฏิกิริยากับน้ำได้เรียกว่าเป็น hydrophilic    ส่วนปลายที่ไม่ทำปฏิกิริยากับน้ำเป็น hydrophobic ด้วยคุณสมบัติของไขมันนี้เองทำให้มันฟอร์มรูปร่างเป็น bilayer ใน membrane     โดยที่ภายนอก membrane เป็นส่วน hydrophilic     และส่วนในเป็นhydrophobic      ไขมันพวกนี้เรียกว่าเป็น amphipathic lipids มักจะเป็นพวก phospholipids 

bacterial membrane จะต่างจากของ eucaryotes คือ มักจะไม่มี sterols เช่น cholesterol     แต่อย่างไรก็ตามแบคทีเรียหลาย ๆ ชนิด  ที่ membrane จะมี pentacyclic sterol-like molecules ชื่อว่า hopanoids       สาร hopanoids นี้เองสังเคราะห์มากจาก precursors ชนิดเดียวกับ precursors ที่ใช้สังเคราะห์ steroids         หน้าที่ของสาร hopanoids คือ ทำให้โครงสร้าง membrane แข็งแรงอยู่ตัว       membrane ของแบคทีเรียจะเรียงตัวกันเป็น bilayer หรือ sheets         membrane โดยทั่วไปมีความหนาประมาณ 5-10 nm        membrane ของ archaea ต่างจากแบคทีเรียอื่น ๆ คือ โดยทั่วไปมักจะมี  membrane 1 ชั้นที่มีโมเลกุลของ lipids กระจายอยู่ทั่ว membrane

model สำหรับ โครงสร้างของ membrane ที่ยอมรับกันในปัจจุบันคือ fluidmosaic model  ของ S. Jonathan Singer และ Garth Nicholson  ในmodel นี้มี membrane proteins 2 ชนิดที่แยกประเภทออกจากกันชัดเจนคือ

1)       Peripheral proteins ซึ่งติดกับ membrane และง่ายต่อการแยกออก ละลายน้ำได้และเป็น 20-30 % ของ total membrane proteins 

2)  Integral proteins เป็น 70-80 % ของ membrane proteins ซึ่งจะแยก (extract) ออกจาก membrane ค่อนข้างยากและจะไม่ค่อยละลายน้ำเมื่อแยกออกมากจาก lipids integral proteins มีคุณสมบัติเหมือน membrane lipids คือมีคุณสมบัติ amphipathic คือมี hydrophobic regions ฝังตัวอยู่ใน lipid และส่วนที่เป็น hydrophilic จะหันออกจาก membrane surface ที่ผิวด้านนอก (outer membrane) ของ plasma membrane    นอกจากนี้ proteins จะมี carbohydrates มาเกาะอยู่        carbohydrates เหล่านี้ก็มีหน้าที่ที่สำคัญต่อเซลล์

Plasma membrane ทำหน้าที่สำคัญคือ เป็น membrane ที่คอยกั้นแยกเซลล์จากสิ่งแวดล้อมรอบ ๆ เซลล์     ชั้นของ plasma membrane ทำหน้าที่ชั้นกั้นให้สารเข้าออกจากเซลล์       สารหลายชนิดไม่สามารถออกจาก plasma membrane ได้     นอกจากนี้แล้ว plasma membrane ยังทำหน้าที่ขนส่งสารอาหารเข้าออกเซลล์      ใน procaryotes ชั้น plasma membrane เป็นที่ ๆ มีเมตาโบลิซึมต่าง ๆ   และก็เป็นที่ที่มี chemoreceptors ที่คอยตอบสนองต่อโมเลกุลสารเคมีต่างๆ

2.2    Internal Membrane System

Internal membrane system อยู่ใน eucaryotes เช่น mitochodria และ chloroplasts     ใน procaryotes มี organells ที่มี membrane อยู่ คือ mesosome มีลักษณะเป็น vesicles กลม ๆ หรือหลอด tubeles พบทั้งในแบคทีเรีย Gram-pos และ Gram-neg 

มักจะพบ mesosome บริเวณ septa ของแบคทีเรีย หรือติดอยู่กับ chromosome     mesosome มีหน้าที่ๆสำคัญในการสร้าง cell wall,  chromosome replication  และการแยกกันของเซลล์ออกจากกัน

อย่างไรก็ตามมีแบคทีเรียหลาย ๆ ชนิดมี internal membrane ที่ไม่ใช่ mesosome     ใน photosynthetic bacteria เช่น cyanobacteria, purple bacteria และ nitrifying bacteria จะมี plasma membrane ที่ซับซ้อนทำให้เกิดเป็น internal membranes ภายในเซลล์ประโยชน์เพื่อการสังเคราะห์แสง

3.      The Cytoplasmic matrix

Cytoplasmic matrix คือ สารที่อยู่ระหว่าง plasma membraneกับ nucleoid ซึ่งมีองค์ประกอบเป็นน้ำ 70 % มักจะเต็มไปด้วย ribosome และมีการ organise อย่างดี  โปรตีนบางชนิดจะอยู่ในบริเวณที่เฉพาะเท่านั้นเช่น บริเวณขั้วเซลล์ (cell poles)

plasma membrane + องค์ประกอบต่าง ๆ ใน plasma membrane = protoplast

3.1    inclusion bodies

เป็น granules ที่มักจะเป็นที่ใช้เก็บสารอินทรีย์และสารอนินทรีย์เช่น สารคาร์บอน, สารอนินทรีย์      และสารพลังงาน     inclusion bodies บางชนิดเกาะติดกับ membrane บางชนิดลอยอยู่ใน cytoplasm ตัวอย่างของ inclusion bodies เช่น polyphosphate granules, cyanophycin granules และ glycogen granules         inclusion bodies บางชนิดมีเยื่อหุ้มอยู่ 1 ชั้น เช่น poly-b-hydroxybutyrate granules, carboxysomes และ gas vacuoles 

สารพวก poly-b-hydroxybutyrate (PHB) จะพบในแบคทีเรียบางสปีชีส์เท่านั้น   สารพวกนี้สามารถย้อมได้ด้วยสี sudan black และเห็นด้วยการส่องดูด้วยกล้อมจุลทรรศน์   อย่างไรก็ตามทั้ง glycogen และ PHB inclusion bodies เป็น carbon storage reservoirs ใช้เป็นแหล่งสร้างพลังงาน กับแบคทีเรีย

ใน cyanobacteria จะมี inclusion bodies ที่พิเศษ 2 ชนิดคือ

1)       cyanophysin granules ทำจาก polypeptide ภายในมีกรดอะมิโน arginine กับ aspartic acid ในปริมาณที่เท่า ๆ กัน สามารถมองเห็น granules นี้ได้ด้วยกล้องจุลทรรศน์แสง     granule นี้เป็นแหล่งสะสม nitrogen ของแบคทีเรีย

2)       carboxysome พบใน cyanobacteria, nitrifying bacteria และ thiobacili ภายในเป็นที่เก็บเอนไซม์ ribulose–1,5-bis phosphate carboxylase และอาจจะเป็นแหล่งของ CO₂ fixation อีกด้วย

gas vacuole เป็น organic inclusion body ที่น่าทึ่งที่สุดในบรรดา inclusion bodiesทั้งหมด พบใน cyanobacteria, purple bacteria, green photosynthetic bacteria และใน aquatic bacteria พวก Halobacterium  และ Thiothrix      แบคทีเรียเหล่านี้จะลอยอยู่ที่ผิวน้ำได้เพราะมี gas vacuoles                gas vacuoles ประกอบด้วย gas vesicles (มีรูปร่างเป็นทรงกระบวก) รวม ๆ กัน     ผนังของ gas vesicle เป็นเพียง protein สายสั้นๆ 1 สาย ที่เรียงตัวกันเป็นรูปทรงกระบอก และจะให้ก๊าซเข้าออกได้   แต่น้ำจะเข้าออกไม่ได้    การควบคุมการลอยตัวของแบคทีเรียโดย gas vacuoles นั้น  ขึ้นอยู่กับความลึกที่แบคทีเรียจะพบสารอาหาร ออกซิเจน และแสงที่เหมาะสม ถ้าแบคทีเรียต้องการจะจมตัว gas vacuoles ก็จะถูกทำลายและจะถูกสร้างมาใหม่ ถ้าแบคทีเรียต้องการจะลอยตัว

  

ในส่วนของ inorganic inclusion bodies มี 2 ประเภทหลัก ๆ คือ

1) polyphosphate granules หรือ volutin granules        polyphosphate เป็น polymer ของ orthophosphate ต่อกันด้วยพันธะ ester        volutin granules มีหน้าที่เป็นแหล่งเก็บ phosphate ซึ่งเป็นองค์ประกอบที่สำคัญของ nucleic acid   และบางที phosphate ก็เป็นแหล่งพลังงานได้ เรียกว่า metachromatic granules (metachromic effect คือ ลักษณะที่ปรากฏเป็นสีแดงหรือสีฟ้าหลาย shade เมื่อ grunules ถูกย้อมด้วยสี methylene blue หรือ toluidine blue (blue dyes))

2)       sulfer granules  พบใน purple photosynthetic bacteria ซึ่งใช้ H₂S เป็น                electron donor-magnetosome เป็น inorganic inclusion body ชนิดหนึ่งซึ่งถูกใช้โดยแบคทีเรียบางชนิดเพื่อจะจัดเรียงตัวเองตาม earth’s magnetic field ซึ่งจะมี iron ชนิด magnetite (Fe₃O₄)

3.2    Ribosomes

Procaryotic ribosome เป็น 70S ribosome ประกอบด้วย 50S และ 30S subunit  (S=Svedberg unit = sedimentation coefficient =sedimentation velocity in a centrifuge = ยิ่งตกตะกอนเร็วยิ่งมี S มาก)

Ribosome ทำหน้าที่เป็นบริเวณที่ใช้สังเคราะห์โปรตีน พบได้มากใน cytoplasmic matrix    นอกจากนี้ยังพบที่ plasma membrane อีกด้วย      ribosomes ที่พบที่ plasma membrane จะทำหน้าที่ขนส่งโปรตีนออกไปข้างนอก โปรตีนที่ได้จากการสังเคราะห์ใหม่ ๆ นั้นสามารถฟอร์มเป็นรูปร่าง (final shape) เองได้ทันทีหรือหลังจากถูกสังเคราะห์ไม่นาน      การเกิดรูปร่างของโปรตีนนั้นขึ้นอยู่กับองค์ประกอบของamino acid ที่ต่อ ๆ กันบนสายโปรตีนนั้น ๆ  มีโปรตีนชนิดพิเศษชนิดหนึ่งชื่อ chaperones เป็นโปรตีนที่ช่วยให้สาย polypeptide ที่สังเคราะห์มาได้เกิดการฟอร์มตัวเป็นโครงสร้างที่เหมาะสม

4. The Nucleoid

           ใน procaryotes โครโมโซมอยู่ในบริเวณที่เรียกว่า nucleoid (อาจเรียกว่า nuclear body, chromatin body หรือ nuclear region)    ดีเอ็นเอของ procaryotes เป็น double-stranded deoxyribonucleic acid  ในแบคทีเรียที่กำลังเจริญเติบโต nucleoid จะมีทิศทางยื่นออกไปสู่ cytoplasmic matrix  การเกิดการยื่นของ nucleoid เกิดจากที่สาย DNA ถูก transcribed เพื่อสร้าง mRNA

     จากการศึกษาด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนพบว่า nucleoid นั้นจะสัมผัสกับ mesosome หรือ plasma membrane จึงทำให้สรุปได้ว่า membranes นั้นช่วยในการแยก DNA ระหว่างการแบ่งเซลล์  nucleoid ประกอบด้วย 60 % DNA, 30% RNA   และ 10% protein โดยน้ำหนัก

             แบคทีเรียหลาย ๆ ชนิดนอกจากมี chromosome แล้ว ยังมี plasmids เป็น extra chromosomal DNA    plasmid เป็น double – stranded DNA molecules (ส่วนมากเป็น circular) สามารถ replicate ได้เอง               plasmid โดยมากจะไม่ติดสัมผัสกับ plasma membrane และสามารถหายไปได้ระหว่าง cell division       plasmids ทำให้แบคทีเรียดื้อต่อยาปฏิชีวนะ ทำให้แบคทีเรียมีความสามารถใหม่ในกระบวนการเมตาโบลิซึมและทำให้แบคทีเรียก่อให้เกิดโรคได้

5. The Procaryotic Cell Wall

cell wall ของ procaryotes เป็นผนังเซลล์ที่ค่อนข้างแข็งแรง   ทำหน้าที่เป็นโครงสร้าง   ให้ความแข็งแรงและป้องกัน osmotic lysis        โครงสร้างของ cell wall ที่แข็งแรงได้มาจากโครงสร้างของ peptidoglycan   นอกจากนี้แล้วองค์ประกอบของ cell wall ยังทำให้เกิดลักษณะ pathogenicity ของแบคทีเรียนั้น ๆ    และcell wall ยังเป็นชั้นผนังเซลล์ที่ป้องกันสารพิษได้

      Gram-positive cell wall: stained purple, หนา 20-80 nm มีชั้นของ peptidoglycan หรืออีกชื่อหนึ่งว่า murein layer ปกคลุมรอบ plasma membrane  เนื่องจากผนัง peptidoglycan layer ที่หนาทำให้ cell wall ของ gram-pos แข็งแรงกว่า gram-neg

      Gram-negative cell wall : stained pink or red, หนา 2-7 nm  มีชั้นของ peptidoglycan layer ที่หุ้มด้วย outer membrane หนา 7-8 nm  นักจุลชีววิทยามักจะผนังที่อยู่ถัดจาก plasma membrane ทั้งหมดว่าเป็น envelope หรือ cell envelope (ซึ่งรวมถึงโครงสร้าง capsule ด้วย: ถ้ามี)

    ใน Gram-neg bacteria มีช่องว่างระหว่าง plasma membrane และ outer membrane เรียกว่า periplasmic space   จากการศึกษาพบว่า periplasmic space ประกอบด้วย network ของ peptidoglycan   สารต่าง ๆ ที่อยู่ในชั้น periplasmic space จะเรียกว่า periplasm    ความหนาของ periplasmic space สามารถหนาได้ตั้งแต่ 1 nm ถึง 71 nm ถ้าเราแยก periplasm มาศึกษาจะพบว่ามี periplasmic enzyme หรือ proteins อยู่หลายชนิด   โปรตีนเหล่านี้เป็นโปรตีนในกลุ่ม hydrolytic enzymes (ซึ่งจะคอยขนส่งสารต่าง ๆ เข้าเซลล์), peptidoglecan synthetic enzyme  และ enzymes ที่คอยจัดการกับ toxic compounds ที่เป็นอันตรายกับเซลล์

       ใน Gram- pos bacteria มี secreted enzymes เรียกว่า exoenzymes       periplasmic space ของ gram-pos bacteria จะสังเกตเห็นได้ยาก     ภายในจะมี enzyme ต่าง ๆ อยู่เช่นกันแต่มักจะเกาะติดอยู่กับ plasma membrane

5.1    peptidoglycan structure

Peptidoglycan หรือเรียกว่า murein เป็นโครงสร้างสาร polymer ที่ประกอบด้วยหน่วยหลาย ๆ หน่อยต่อ ๆ กันซึ่ง polymer 1 หน่วยจะประกอบด้วย 2 sugar derivatives คือ N-acetylglucosamine (NAG) กับ N- acetylmuramic acid (NAM)  ซึ่งจะมี amino acids 3 ชนิดมาต่อเข้ากับ NAG-NAM ก็คือ D- glutamic acid, D- alanine และ meso-diaminopimelic acid ซึ่งกรดอะมิโนทั้ง 3 ชนิดนี้ จะไม่พบในโปรตีนทั่ว ๆ ไป        D – amino acid ทั้ง 3 ชนิดนี้ทำให้โครงสร้างของ peptidoglycan นั้นไม่สามารถถูกทำลายได้ด้วย peptidases อย่างไรก็ตามในแบคทีเรีย gram-neg และ gram-pos บางชนิดจะมี diaminoacids คือ L-lysine มาแทน meso-diaminopimelic acid

การเชื่อมกันของ peptidoglycan subunits จะเชื่อมกันด้วยพันธะ peptide โดยตรง      คือ หมู่ carboxyl group ของ D-alanine ต่อกับ diaminopimelic acid โดยตรงหรือใช้ peptide (ไม่ค่อยพบ peptide interbridge)      โครงสร้าง peptidoglycan ที่เชื่อมกันด้วย  peptide interbridge จะทำให้เกิด peptidoglycan sac (ถุง)     ที่หนาใหญ่

5.2    Gram-Positive Cell Walls

Gram-positive cell walls โดยทั่วไปจะหนาประกอบด้วย peptidoglycan   ซึ่งมักจะมี peptide interbridge อย่างไรก็ตาม Gram-pos bacteria cell walls มักจะมีองค์ประกอบของ teichoic acids (polymers ของ glycerol (หรือเป็น ribitol) เชื่อมกันด้วย phosphate groups)  อยู่มากมาย 

teichoic acids นี้ไม่พบใน Gram-negative bacteria         teichoic acids มีหน้าที่ช่วยสร้างความแข็งแรงให้กับ cell wall กับ  Gram-positive bacteria phosphate glycerol ที่ teichoic acid structure นั้นมีหมู่ side chain (R) เป็น D- alanine หรือ glucose เป็นส่วนใหญ่

teichoic acids ต่อกับ peptideglycan หรือถ้าต่อกับ plasma membrane lipids จะทำให้ teichoic acid ถูกเรียกว่าเป็น lipoteichoic acids

5.3  Gram-Negative cell walls

Cell wall ของแบคทีเรียแกรมลบนั้นซับซ้อนกว่าของแกรมบวก มี peptidoglycan layer อยู่ประมาณ 5-10 % ของ cell wall weight

Outer membrane เป็นชั้นที่อยู่ถัดออกไปจาก peptidoglycan layer และเป็นผนังชั้นนอกสุด

      ที่ชั้นนี้มีโปรตีนชนิดหนึ่งชื่อ   Braun’s lipoprotein อยู่มากมาย      โครงสร้างอีกอย่างหนึ่งที่สำคัญของ cell wall คือ adhesion site คือบริเวณที่ outer membrane กับ  plasma membrane นั้นสัมผัสกัน

โครงสร้างชนิดหนึ่งที่พิเศษของ outer membrane คือ lipopolysaccharides (LPSs) ซึ่ง

ประกอบด้วย 1) lipids A ,    2) the core polysaccharide และ    3) the O side chain

LPS ที่ถูกศึกษามากมาจาก Salmanella typhimurium  

lipid A คือ ส่วนที่ประกอบด้วย glucosamine sugar derivatives ที่ต่อกับ 3 fatty acids และ

phosphate (หรือ pyrophosphate)     core polysaccharide เป็นโครงสร้างของ 10 sugars ซึ่งจะมีโครงสร้างที่แตกต่างจากน้ำตาลทั่ว ๆ ไป         O side chain หรือ O antigen เป็น polysaccharide chain ที่มี sugars ชนิดพิเศษมาต่อกัน แบคทีเรียแกรมลบสามารถเปลี่ยนโครงสร้างของ Oside chains ได้ทำให้หลบกลไกการ detect ของ host antibodies ได้

LPS มีคุณสมบัติที่น่าสนใจหลายอย่าง เช่น core polysaccharide จะประกอบด้วย charged sugar และ phosphate ซึ่งจะทำให้ผนังเซลล์ของแบคทีเรียมีประจุเป็นลบ               และ LPS ยังให้ความแข็งแรงกับโครงสร้างของ membrane structure     นอกจากนี้แล้ว lipid A ยังเป็น toxic ดังนั้น LPS สามารถเป็น endotoxin ได้อีกด้วย     ซึ่งจะทำให้อาการติดเชื้อจากแบคทีเรียแกรมลบนั้นรุนแรงขึ้น

Outer membrane นอกจากเป็นผนังที่คอยป้องกันการเข้ามาของ bile salts, antibiotics และ toxic substances แล้ว   ยังมี porin proteins ซึ่งคอยช่วยให้ small molecule เช่น glucose monosaccharides และโมเลกุลอื่นที่ขนาดเล็กกว่า 600-700 ผ่านเข้ามาได้    ส่วนโมเลกุลอื่นเช่น vitamin B₁₂ ต้องขนส่งโดยใช้โครงสร้างพิเศษชนิดอื่น

5.4    The Mechanism of Gram Staining

ถ้าเราแยกเอาผนัง cell wall ของ แบคทีเรียแกรมบวกออกไป   จะทำให้แบคทีเรียแกรมบวกกลายเป็นแกรมลบ สาร peptidoglycan นั้นไม่สามารถติดสีได้ แต่จะเป็นโครงสร้างที่ป้องกันการหลุดของสี crystal violet           

ในการย้อมแกรม ขั้นตอนที่ 1 ย้อมด้วย crystal violet ขั้นตอนที่ 2 ย้อมด้วย  iodine ซึ่งจะทำให้สี crystal violet นั้นติดคงทนขึ้น   เมื่อแบคทีเรียแกรมบวกถูกล้างสีออกด้วย ethanol (ขั้นตอนที่ 3) ethanol จะทำให้ pore (รู) ซึ่งอยู่ที่โครงสร้าง peptidoglycan หดตัวทำให้ crystal violet –iodine complex ยังติดอยู่ที่ผนังเซลล์ ทำให้แบคทีเรียแกรมบวกติดสีน้ำเงิน-ม่วง            ในทางกลับกันแบคทีเรียแกรมลบจะมีชิ้น peptidoglycan ที่ค่อนข้างบางไม่ค่อยมี cross-linked กันมากนักและมี pore ที่ค่อนข้างรูใหญ่กว่า   ในขั้นตอนการล้างด้วย ethanol จะทำให้ชะล้างเอาพวก lipid ออกไปจาก cell wall ของแบคทีเรียแกรมลบ     ทำให้ cell wall ของแบคทีเรียแกรมลบมีคุณสมบัติ porosity เพิ่มขึ้น     และสีของ crystal violet-iodine complex ก็ถูกชะล้างไป

5.5   The Cell Wall and Osmotic Protection

โดยทั่วไปแล้ว cell wall มีหน้าที่ปกป้องแบคทีเรียจากการถูกทำลายโดย osmotic pressure เพราะว่าสารละลายในตัวของแบคทีเรียเองนั้นมีความเข้มข้นกว่าสารที่แวดล้อมตัวมันซึ่งโดยทั่วไปแล้วจะทำให้ตัวทำละลาย (solutes) นั้นเคลื่อนที่เข้ามาภายในเซลล์    ถ้าน้ำเข้ามามาก ๆ เซลล์จะ swell และถ้า cell wall รับกับ osmotic pressure ไม่ได้ก็จะ lysis          แต่ถ้าสารละลายที่อยู่แวดล้อมมีความเข้มข้นของน้ำน้อยกว่าภายในเซลล์ของแบคทีเรีย น้ำจากแบคทีเรียก็จะไหลออกไป ทำให้เซลล์เหี่ยวเรียกว่า plasmolysis

การปกป้องเซลล์โดย cell wall    สามารถทดลองแสดงให้เห็นโดยการทดลอง treat เซลล์ของแบคทีเรียโดย lysozyme หรือ penicillin      lysozyme จะ hydrolyse พันธะที่เชื่อมกันระหว่าง N- actylmuramic acid กับ N- acetylglucosamine ในโครงสร้าง peptidoglycan                ส่วน penicillin จะยับยั้งการสังเคราะห์ peptidoglycan แบคทีเรียแกรมบวก (ถ้า incubated กับ penicillin ในสารละลาย isotonic silution)  ผนังเซลล์ของแบคทีเรียแกรมบวกจะถูกเปลี่ยนให้เป็นโครงสร้าง protoplast (โครงสร้างที่ไม่มี cell wall ) ถ้าเป็นแบคทีเรียแกรมลบใน condition เดียวกันเซลล์จะถูกเปลี่ยนไปเป็นโครงสร้างแบบ spheroplast (โครงสร้างที่ cell wall บางส่วนยังคงอยู่) ถ้า protoplast และ spheroplast ถูกย้ายไปในที่ ๆ สารละลายเจือจางกว่า เซลล์จะแตกเนื่องจากโครงสร้างทั้ง 2 นี้ควบคุมการเข้าออกของน้ำไม่ได้ 

มีแบคทีเรียพวก mycoplasma ที่ไม่มี cell wall แต่ก็ยังสามารถอาศัยอยู่ในสภาวะแวดล้อมทั่ว ๆ ไปได้     อันนี้ก็อาจจะเป็นเพราะ mycoplasma มี plasma membrane ที่แข็งแรง      อาจเป็นเพราะมีสาร sterols เป็นองค์ประกอบที่ plasma membrane

6     Components External to the Cell wall

6.1  Capsules, Slime Layers and S-layers

ในแบคทีเรียบางชนิดจะมีผนังอีกชั้นหนึ่งอยู่ถัดจาก cell wall          ถ้าผนังชั้นนี้มีการจัดเรียงตัวกันดี และเราทำการแยกออกไปได้ยากจะเรียกว่า capsule       ถ้าผนังชั้นนี้สามารถล้างแยกออกไปได้ง่ายมีการจัดเรียงตัวกันไม่ดี เรียกว่าเป็น slime layer ซึ่งเป็นโซนสำหรับการ diffusion        นอกจากนี้แล้วยังมีโครงสร้างอีกชนิดหนึ่งเรียกว่า glycocalyx ซึ่งเป็นเส้นใย network ของ polysaccharides ที่ออกมาจากผนังเซลล์ของแบคทีเรียที่ไปเกาะติดกับผนังเซลล์ของแบคทีเรียอีกตัวหนึ่งหรือกับเซลล์อื่น   capsule และ slime layer ทำมาจาก polysaccharides มีข้อยกเว้นในบางอย่างเช่น Bacillus anthracis   capsule จะเป็น poly-D-glutamic acid              capsules นั้นสามารถย้อมสีตรวจดูได้

     ประโยชน์ของ capsule คือ ช่วยป้องกัน phagocytosis โดย phagocytic cells ของ host  ยกตัวอย่างเช่น ใน Streotococcus pneumoniae  ถ้ามันไม่มี capsule มันจะถูกทำลายได้โดยง่ายและไม่ก่อให้เกิดโรค   นอกจากนี้แล้ว capsule ยังช่วยแบคทีเรียในเรื่องการป้องกัน bacteria viruses ป้องกันสารพิษช่วยการเกาะติดของแบคทีเรียกับวัตถุหรือสิ่งมีชีวิตอื่น และยังช่วยในการ gliding อีกด้วย

มีแบคทีเรียแกรมบวกและแกรมลบหลาย ๆ ชนิดที่มีผนังชั้นนอกเป็น S-layer       S-layer ยังเป็นผนังที่พบโดยทั่วไปในแบคทีเรียกลุ่ม archaea (อยู่รอบ plasma membrane)  S-layer มีโครงสร้างคล้ายกับพื้นลาย ๆ ซึ่งประกอบด้วย glycoprotein  หน้าที่ช่วยป้องกันเซลล์จากไอออน (ion) หรือ pH ที่ขึ้น ๆ ลง ๆ, osmotic stress, enzymes   ช่วยให้แบคทีเรียคงรูปร่างอยู่ได้,   ช่วยป้องกัน phagocytosis และ S- layer ยังทำให้เกิดพยาธิสภาพได้อีกด้วย

6.2  Pili and Fimbriae

     แบคทีเรียแกรมลบหลายชนิดมีขนสั้น ๆ (เล็กกว่า flagella) ที่ไม่เกี่ยวข้องกับการเคลื่อนที่เรียกว่า fimbriae (a fimbria)        fimbriae มีขนาดเล็กมาก ถึงแม้จะมีถึง 1,000           fimbriae  มองเห็นได้โดยกล้องจุลทรรศน์อิเลคตรอนเท่านั้น     fimbriae บางชนิดในแบคทีเรียช่วยในการยึดเกาะกับวัตถุและ host tissue

      sex pili (a pilus) คล้ายๆกับ fimbriae แต่จะมีแค่ 1-10 อันต่อ 1 cell แต่จะต่างกับ fimbriae คือ ใหญ่กว่า (9-10 nm in diameter) และแบคทีเรียใช้ sex pili ในการ mating หรือถ่ายทอดสารพันธุกรรมไปให้แบคทีเรียอีกตัวหนึ่ง

6.3    Flagella and Motility

ส่วนมากแบคทีเรียที่สามารถเคลื่อนที่ได้ ใช้ flagella (a flagellum) ช่วยให้เคลื่อนที่      flagella มีขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 20 nm ยาว 15-20 mm

เราสามารถจัดจำแนกแบคทีเรียโดยดูจาก flagella ได้     monotrichous bacteria เป็นแบคทีเรียที่มี flagella 1 อัน (trichous หมายถึง hairs) มักอยู่ที่ปลายเซลล์ ซึ่งจะเรียกว่า polar flagellum                 amphitrichous bacteria มี flagella 2 อันอยู่ที่หัวท้ายของเซลล์         peritrichous bacteria เป็นแบคทีเรียที่มี flagella ปกคลุมรอบเซลล์สม่ำเสมอทั่วเซลล์ (peri หมายถึง around)

            6.3.1           Flagella Ultrastructure

จากการศึกษา flagella ด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเลคตรอนพบว่า flagellaประกอบด้วยโครงสร้าง 3 ส่วนคือ

1.       filament ซึ่งเป็นส่วนที่เห็นชัดเจนที่สุด ยาวที่สุด ยื่นออกมาจาก cell wall ของแบคทีเรีย

2.       basal body ส่วนที่อยู่ภายในเซลล์

3.       hook เป็นส่วนที่เชื่อม filament กับ basal body เข้าด้วยกัน ช่วยทำให้เกิดการบิดงอ

filament เป็นโครงสร้างรูปทรงกระบอกทำมาจากโปรตีน flagellin      ที่ปลาย filament เป็น capping protein ในแบคทีเรียบางชนิด filament จะมี sheaths ห่อหุ้ม filament อีกชั้นหนึ่ง       อย่างเช่นใน  Vibrio cholerae จะมี sheaths ซึ่งเป็น polysaccharide sheath ห่อหุ้ม filament อยู่

ส่วนที่เป็น hook และ basal body จะมีความกว้างกว่า filament        และ basal body จะมีความกว้างกว่า filament  และสร้างมาจากโปรตีนต่างชนิด    โครงสร้างของ basal body นั้นซับซ้อน 
  ในแบคทีเรีย E. coli และแบคทีเรียแกรมลบส่วนมาก basal body มี 4 rings ต่อกับ central rod    2 rings ที่อยู่ด้านนอก เป็น L และ P ring ที่อยู่ที่ชั้น lipopolysaccharide layer และ peptidoglycan layar ตามลำดับ         2 ring ด้านในเป็น M ring  ที่อยู่ที่ชั้นของ plasma membrane         ส่วน S ring ที่อยู่ติดกับ M ring  ถัดออกมาในแบคทีเรียแกรมบวกจะมีอยู่แค่ 2 ring คือ อันหนึ่งอยู่ที่ชั้น plasma membrane (ininer ring)  ส่วนอีกอันหนึ่งอยู่ที่ชั้น peptidoglycan (outer ring)

6.3.2           Flagella Synthesis

ในกระบวนการสังเคราะห์ flagella นั้นใช้ยีน 20-30 ยีนส์  ใช้ยีน 1 ยีนในการสังเคราะห์ flagellin 
ใช้ยีน ³ 10 ยีนส์สังเคราะห์ hook และ basal body proteins   และยีนอื่น ๆ จะคอยควบคุมการสร้าง flagella และการทำงานของ flagella

ในปัจจุบันนักวิทยาศาสตร์ ไม่รู้ว่า เซลล์มีวิธีควบคุมหรือมองหาจุดที่เหมาะสมในการสร้าง flagella อย่างไร    เชื่อว่าในการสร้าง flagella นั้น โปรตีน flagellin subunits จะถูกส่งผ่าน filament ’s hollow internal core ออกไป เมื่อไปถึงปลาย flagellin subunits จะเรียงตัวเอง ตามขึ้นไปปลาย flagella เรียกว่าเป็นกระบวนการ self-assembly ซึ่งไม่ได้ใช้โปรตีนอื่นช่วยเลย  

             6.3.3           The Mechanism of flagellar movement

การเคลื่อนไหวของแบคทีเรียโดย flagella คล้ายกับเรือหางยาว ที่ใบพัดจะหมุนเป็นเกลียว            การหมุนของ flagella ใน E. coli จะอยู่ที่ประมาณ 270 รอบต่อวินาที         polar flagella จะหมุนในทิศทางทวนเข็มนาฬิกาและไปข้างหน้า      แบคทีเรียที่มี polar flagella จะสามารถหยุดหรือเคลื่อนไหวนิ่ง ๆ อยู่กับที่  โดยหมุน flagella ในทิศทางที่กลับกัน ใน peritrichously flagellated bacteria ก็เหมือนกันคือ เมื่อแบคทีเรียต้องการที่จะเคลื่อนที่ด้านหน้าก็จะงอ flagella มารวมกันด้านหนึ่งแล้วหมุน flagella ทวนเข็มนาฬิกาเมื่อต้องการหยุดก็จะหมุน flagella ตามเข็มนาฬิกา 

แท่งที่เป็นแกนกลางของ flagella (rod และ shaft) จะเป็นแกนกลางที่อยู่ตรง M ring ถึงโคน hook ซึ่งจะสามารถหมุนได้อย่างอิสระ              เชื่อกันว่า S ring นั้นจะติดอยู่กับผนังเซลล์ของแบคทีเรียแกรมบวกและจะไม่หมุน               P และ L ring นั้นจะเป็นตัวช่วยประคองระหว่างที่ rod หมุน                 กลไกการหมุนของ basal body นั้นยังไม่ชัดเจน แต่มีหลักฐานสนับสนุนว่า basal body นั้นอาจจะมีการหมุนได้ 

M และ C ring นั้นอยู่ที่ชั้น plasma membrane      C ring นั้นประกอบด้วยโปรตีน Fli  M , Fli N และ Fli G       และโปรตีนอีก 2 ชนิดคือ Mot A และ mot B (ติดกับ plasma membrane) อยู่ข้างๆ M และ C ring    มีหลักฐานว่า mot A และ Fli G มีปฏิสัมพันธ์กันระหว่างที่ flagella หมุน            กลไกการหมุนของ flagella นั้นอาศัย sodium (หรือ protein) gradients ใน prokaryotes         ส่วนใน eukaryotes นั้นอาศัย ATP  

Flagella นั้นทำงานได้ค่อนข้างมีประสิทธิภาพ คือ ทำให้แบคทีเรียวิ่งได้ 20-90 µm ต่อวินาที หรือเท่ากับ 2-100 ช่วงตัวต่อวินาที    แบคทีเรียบางชนิดใช้กลไกอื่นในการเคลื่อนที่ เช่น spirochetes สามารถหมุนตัวและว่ายน้ำได้โดยอาศัย axial filament (เป็น periplasmic flagella)      แบคทีเรียกลุ่ม cyanobacteria,  myxobacteria cytophagas และ mycoplasmas (บางชนิด) เคลื่อนไหวโดย gliding motility

7.      Chemotaxis

           "Movement toward chemical attractants and away from repellents is called chemotaxis"

การศึกษาการเคลื่อนที่ของแบคทีเรียสามารถทำได้ในหลอดขนาดเล็ก ๆ    หรือง่ายที่สุดคือการศึกษาการเคลื่อนที่บนวุ้นบนจานเลี้ยงเชื้อ (petridish)    ถ้านำ acetate (แบคทีเรียไม่ชอบ) ชุบแผ่นกรองวงกลมแล้ววางบน semisolid agar ที่มีเชื้อ E. coli อยู่จะพบว่า E. coli  จะเคลื่อนที่หนีห่างจากแผ่นกรองนี้ ทำให้เห็นเป็น clear zone ใส่รอบแผ่นกรองที่ชุบ acetate ยิ่งแผ่นกรองที่ชุบ acetate ที่มีความเข้มข้นสูงๆ clear zone ก็จะยิ่งกว้างขึ้น 

Attractants และ repellants นั้นถูกตรวจสอบโดย chemoreceptors ซึ่งเป็นโปรตีนชนิดพิเศษที่จะจับกับสารเคมีแล้วส่งสัญญาณไปยัง chemosensing system

Chemotactic behavior ของแบคทีเรียในการเคลื่อนที่ก็ได้ถูกศึกษาเช่นกัน ซึ่งโดยทั่วไปแบคทีเรียจะวิ่งเข้าหาบริเวณที่ความเข้มข้นของอาหารสูง ๆ  ยังกลไกการเคลื่อนที่ตามสิ่งเร้าอื่นอีก 4 แบบ คือ 1) aerotaxis 2) phototaxis 3) thermotaxis และ 4) osmotaxis

8.      The Bacterial Endospore

ในแบคทีเรียแกรมบวกโครงสร้างพิเศษ เรียกว่า endospore เป็นโครงสร้างที่ทนทานและเป็นโครงสร้างในระยะพักตัวหรือระยะจำศีล        endospore จะพัฒนาขึ้นภายในเซลล์องแบคทีเรียในหลาย ๆ จีนัส เช่น Bacillus, Clostridium , Sporosarcina และอื่น ๆ      endospore จะต้านทานต่อการถูกทำลายด้วยความร้อน รังสี UV รังสีแกมมา สารฆ่าเชื้อได้สูง ตัวอย่างเช่น actinomycete spores ถูกค้นพบในโคลนหลังจากถูกฝังไว้ถึง 7,500 ปี         แบคทีเรียที่มี endospore จะเป็น dangerous pathogens และสำคัญในทางจุลชีววิทยาอุตสาหกรรมและทางการแพทย์          endospore จะเกิดขึ้นเมื่อความชื้นหรือสารอาหารรอบ ๆ แบคทีเรียเหลือน้อยมาก ๆ

เนื่องจาก endospore มักจะไม่ให้สีย้อมเข้าออกได้ ดังนั้นเมื่อย้อมด้วยสีย้อมต่าง ๆ ก็มักจะเห็น endospore เป็นไม่ติดสีเลย (colorless)     endospore สามารถอยู่ในตำแหน่งต่าง ๆ ใน mother cell (sporangium)     แต่โดยทั่วไปมี 3 ลักษณะคือ 1) central spore   2) subterminal spore และ 3) terminal spore   และบางครั้งตรงตำแหน่งที่มี endospoe ก็จะทำให้ sporangium บวมด้วย

การศึกษา endospre ด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเลคตรอน ทำให้ทราบว่า endospore ประกอบด้วยโครงสร้างต่อไปนี้คือ

1)       exosporium : a thin delicated covering

2)      spore coat : protein layers บางครั้งหนามาก ทำหน้าที่ป้องกันสารเคมี 

3)  cortex : ชั้นในถัดจาก spore coat  มีปริมาณประมาณ ½ V (volume) สร้างมา  จาก peptidoglycan

4)       spore cell wall หรือ core wall เป็นชั้นที่ล้อมรอบ protoplast หรือ core

5)       core : ภายในมี normal cell structures เช่น ribosomes และ nucleoid ซึ่งจะไม่ 
       ทำงาน (inactive)

15% ของน้ำหนักแห้งของ spore ประกอบด้วย dipicolinic acid จับกับ calcium ions (calcium – dipicolinate)   ซึ่งอยู่ใน core     ซึ่งคิดว่าสารตัวนี้ทำให้ spore นั้นทนทานต่อความร้อนได้สูง              cortex อาจจะถูกดึงน้ำออกไปหมดจาก core เพื่อป้องกันการที่ core ถูกทำลายโดยความร้อนและรังสี       นอกจากนี้แล้วยังมี acid-soluble DNA –binding proteins ที่ป้องกัน DNA ถูกทำลายจากความร้อน       ภายใน spore ยังมี DNA repair enzyme ซึ่งจะใช้ซ่อมแซม DNA ระหว่างการ  germination    โดยสรุปแล้วการที่ endospore นั้นต้านทานต่อความร้อนได้สูงเนื่องจาก

1)       calcium-dipicolinate

2)       acid-soluble binding proteins

3)       protoplast dehydration

4)       spore coat

5)       DNA repair

Spore formation, sporogenesis หรือ sporulation เป็นการเกิดของ spore เมื่อสารอาหารลดน้อยลง ประกอบด้วย 7 ขั้นตอน 

                ขั้นตอนที่ 1  เกิด axial filament formation

                ขั้นตอนที่ 2 เกิด septum formation : เซลล์เมมเบรนแยกเซลล์เป็น 2 ส่วน

                ขั้นตอนที่ 3 เกิด engulfment of  forespore: membrane เข้ามาห่อหุ้ม immature spore

                ขั้นตอนที่ 4 เกิด cortex formation :เกิดชั้น cortex และมีการสะสม 
                                   ของ calcium และ dipicolinic acid

                ขั้นตอนที่ 5 coat synthesis : protein coats ฟอร์มขึ้นรอบๆ cortex

                ขั้นตอนที่ 6 completion of coat synthesis : การสังเคราะห์ protein coats สมบูรณ์เกิด
                                   เป็น spore  เต็มวัย

                ขั้นตอนที่ 7 เกิด lysis of sporangium :lytic enzyme จะทำการย่อยสลาย  
                                   sporangium ทำให้ spore หลุดออกมา

              ใน Bacillus megaterium กระบวนการของ sporulation ใช้เวลาประมาณ 10 ชั่วโมง  spore germination เป็นการเกิดของแบคทีเรียจาก spore มี 3 ขั้นตอนคือ 1) activation 2) germination  และ  3) outgrowth

   สารเคมีหลายๆชนิดเช่น amino acids และ sugars สามารถกระตุ้นการ germination ได้          เมื่อมีการ germination สปอร์จะบวมขึ้นแตกและสูญเสียคุณสมบัติการต้านทานต่อความร้อนและอุณหภูมิสูง ๆ    หลังจากนั้น spore จะปล่อยโครงสร้างภายในออกมา และเพิ่มเมตาโบลิซึมให้สูงขึ้น โดยที่ spore protoplast จะหลุดออกมาจาก spore coat แล้วพัฒนาเป็น active bacteria (ในขั้น outgrowth)

................................................................................................