การจำลองตัวเองของดีเอ็นเอ (DNA replication)

การจำลองตัวเองของดีเอ็นเอ (DNA replication)

• DNA replication เป็นแบบ semiconservative DNA replication
• การจำลองตัวเองของดีเอ็นเอเป็นแบบ  “กึ่งอนุรักษ์ (semiconservative replication)” หมายความว่า ในดีเอ็นเอคู่ใหม่ที่เป็นดีเอ็นเอ 2 สาย จะมีดีเอ็นเอสายหนึ่งเป็นสายเดิมและดีเอ็นเออีกสายหนึ่งเป็นสายที่สังเคราะห์ขึ้นมาใหม่ 

1.     รูปแบบการสังเคราะห์ดีเอ็นเอ (Patterns of DNA Synthesis)

•       รูปแบบแรกพบในแบคทีเรีย E. coli เมื่อโครโมโซมดีเอ็นเอที่เป็นวงกลม (circular DNA chromosome) ของ E. Coli  มีการจำลองตัวเอง  กระบวนการจำลองตัวเอง (replication) จะเริ่มต้นจากจุด 1 จุด เรียกว่า จุดกำเนิดของการจำลองตัวเอง (origin of replication)  และการสังเคราะห์ดีเอ็นเอสายใหม่จะเกิดขึ้นที่ replication fork เมื่อ replication fork เคลื่อนที่รอบโครโมโซมดีเอ็นเอที่เป็นวงกลม จะเกิดเป็นโครงสร้างคล้ายตัวอักษรกรีก ธีต้า (theta) (q) จนสุดท้ายการกระบวนการจำลองตัวเองเสร็จสิ้น   replication fork จะวิ่งมาชนกันและโครโมโซมก็แยกออกจากกันได้เป็น 2 วง โปรตีนที่ทำหน้าที่ในปฏิกิริยาการสังเคราะห์ดีเอ็นเอสายใหม่ (polymerization) คือ replisome (หรือหนังสือเล่มอื่นจะใช้ชื่อว่า DNA polymerase III )

           

       กระบวนการจำลองตัวเองของดีเอ็นเอ (DNA replication) อีกแบบหนึ่งเกิดขึ้นระหว่างกระบวนการ conjugation ของ E. coli  และการ reproduction ของไวรัส (เช่นฟาจแลมบ์ด้า phage l) เป็นแบบ rolling–circle mechanism โดยขั้นแรกดีเอ็นเอสายหนึ่งถูกตัด (nick) หลังจากนั้นจะมีการสร้างดีเอ็นเอสายใหม่ต่อเข้าที่ปลาย 3’-hydroxy end ของดีเอ็นเอสายที่ถูกตัด และจะสร้างไปจนบรรจบกับบริเวณที่ดีเอ็นเอสายนั้นถูกตัด ขณะเดียวกันดีเอ็นเอสายที่เป็น 5’ ก็จะถูกแทนที่และหลุดออกมา

• การสร้างดีเอ็นเอสายใหม่ (+ strand) เกิดจากปฏิกิริยา polymerization ของ replisome (DNA pol III) เติม deoxyribonucleotides ที่ free 3'-OH   นอกจากนี้ยังมี single – stranded DNA –binding proteins (SSBs) มาจับที่ + strand ด้วยเพื่อป้องกันการถูกทำลาย อีกตัวอย่างหนึ่งของกลไกนี้คือ ใน phage fX174 ที่มี rolling- circle mechanism โดยที่มีเอนไซม์ที่ใช้ตัดดีเอ็นเอชื่อ A protein ที่ใช้เริ่มต้น rolling cycle 

• ส่วนในยูคาริโอตนั้นดีเอ็นเอเป็นเส้นตรงและยาวกว่าใน E. coli มาก  ดังนั้นกระบวนการจำลองตัวเองของดีเอ็นเอจึงมี replication fork เกิดขึ้นหลายจุดพร้อมกัน

2.     กลไกการจำลองตัวเองของดีเอ็นเอ (Mechanism of DNA Replication)

•     the replication of E. coli DNA is probably best understood
•     the process in eukaryotic cells is thought to be similar
•     กระบวนการจำลองตัวเองของดีเอ็นเอมี 4 ขั้นตอนคือ

1.      เริ่มต้นที่ DnA protein เข้ามาจับที่ OriC locus  เพื่อเริ่มต้นคลายเกลียวของสายดีเอ็นเอ หลังจากนั้น helicases (DnaB proteins) จะเข้ามารับช่วงคลายเกลียวสายดีเอ็นเอต่อ เมื่อสายดีเอ็นเอถูกแยกแล้ว จะถูกจับด้วย single-stranded DNA binding proteins (SSBs) เพื่อไม่ให้ดีเอ็นเอกลับมาจับกันอีก     ถ้าเหตุการณ์นี้ ดีเอ็นเอมีการคลายตัวอย่างรวดเร็วจะทำให้เกิดการขดเกลียวแน่น (supertwists) ตรงส่วน helix ด้านบนของ replication fork        ดังนั้นเพื่อไม่ให้เกิดเหตุการณ์นี้    จะมีเอนไซม์ชื่อ DNA gyrase (E. coli topomerase) ช่วยป้องกันการขดเกลียวแน่นนี้เข้ามาช่วย

  

2.      ดีเอ็นเอจะถูกจำลอง (replicated) อย่างต่อเนื่องโดย DNA polymerase III บนสาย leading strand และทิศทางจาก 5' ® 3' (ของ DNA สายใหม่)     
        ส่วนในสาย lagging strand การจำลองตัวเองของดีเอ็นเอจะเป็นแบบไม่ต่อเนื่องและต้องใช้ primase (RNA polymerase) มาสังเคราะห์ RNA primer สายสั้นๆ ประมาณ 10 nucleotides    ซึ่ง primase จะฟอร์มเป็น complex ร่วมกับ โปรตีนอีกหลาย ๆ ชนิดเป็น primosome      จากนั้น DNA polymerase III ก็จะสังเคราะห์ดีเอ็นเอสายใหม่ต่อจาก primers เหล่านี้ (ในทิศทาง 5' ® 3' ของ DNAสายใหม่เช่นกัน) แล้วก็ lagging strand นี้เองจะฟอร์มเป็นห่วง (loop) ด้วย    เพื่อ DNA polymerase III วิ่งไปในทิศทางเดียวกันกับบน leading strand       ดีเอ็นเอสายใหม่ที่สังเคราะห์ได้บนสาย lagging strand จะมีขนาดยาว 1,000 – 2,000 nucleotides (ในแบคทีเรีย) ซึ่งจะเรียกว่า Okazaki  fragments (ตามผู้ค้นพบ Reiji Okazaki)

3.   หลังจากที่ Okazaki fragments  ได้ฟอร์มขึ้นมาเสร็จเรียบร้อยแล้ว เอนไซม์ DNA polymerase I (หรือ Rnase H ) จะทำหน้าที่ตัด RNA primer ออกไป    แล้ว DNA polymerase I จะเข้ามาสังเคราะห์ดีเอ็นเอแทนที่ในส่วนที่ถูกตัดออกไปนี้ 

            สุดท้าย Okazaki fragment จะถูกเชื่อมเข้าด้วยกันด้วย DNA ligase  ในแบคทีเรียเอนไซม์ ligase ใช้ NAD⁺ เป็นสารพลังงาน  ส่วนสิ่งมีชีวิตอื่นใช้ ATP

4.    Termination of DNA replication             กระบวนการจำลองตัวเองของดีเอ็นเอจะหยุด  
      เมื่อ polymerase ไปถึง termination site  ใน E. coli เป็น Ter sites   ถ้ากระบวนการจำลองตัว
      เองของดีเอ็นเอเกิดการผิดพลาด (ลำดับดีเอ็นเอผิดไป) เกิดการกลายพันธุ์ (mutations) ได้                      ถ้าเกิดการกลายพันธุ์มาก ๆ จะเป็นอันตรายกับ E. coli ได้     โดยปกติใน E. coli จะมีการผิด
      พลาดจากกระบวนการจำลองตัวเองของดีเอ็นเอเท่ากับ 10^-9-10^-10 ต่อคู่เบส (bp) หรือ
      ประมาณ 10^-6 ต่อยีนต่อรุ่น การกลายพันธุ์ส่วนหนึ่งเป็นกลไกต่อสู้ต่อสิ่งเร้า เช่น สารเคมี หรือ                   ยาปฏิชีวนะ ดังนั้นการกลายพันธุ์ของแบคทีเรียที่ดื้อยาปฏิชีวนะ จึงเป็นสิ่งที่หลีกเลี่ยงไม่ได้                     ไม่ช้าหรือเร็วกลายพันธุ์ของแบคทีเรียที่ดื้อยาปฏิชีวนะก็ต้องเกิด เพื่อความอยู่รอดของ
       แบคทีเรีย

------------------------------------------------