การถอดรหัสดีเอ็นเอ (DNA Transcription)

การถอดรหัสดีเอ็นเอ (DNA Transcription)

              DNA  -----transcription--->   RNA   ----translation---->    Protein (polypeptide)

1.     บทนำ (Introduction)

RNA product ที่ได้จากกระบวนการ transcription จะมีลำดับเบส complementary กับดีเอ็นเอต้นแบบ (DNA template) กระบวนการ transcription เป็นกระบวนการที่ใช้สังเคราะห์ RNA ทั้ง 3 ชนิดคือ

1. messenger RNA (mRNA)           = อาร์เอนเอนำรหัสใน protein synthesis

2. transfer RNA (tRNA)                  = ผู้ขนส่งกรดอะมิโนในกระบวนการ protein synthesis

3. ribosomal RNA (rRNA)               = โมเลกุลที่เป็นองค์ประกอบของไรโบโซม

  

2.     กระบวนการถอดรหัสในโปรคาริโอต (Transcription in Procaryotes)

·       Prokaryotic mRNA เป็น single-stranded RNA มีความยาวขนาดต่าง ๆ กันไป            mRNA ของโปรคาริโอต มีส่วนที่ไม่ใช้ถอดรหัสเป็นโพลีเปปไทด์ (polypeptide) รวมอยู่ด้วยเรียกว่า nontranslated leader sequence ยาว 25-150 bp         และที่ปลาย 5’- end ของ mRNA และใน polygenic mRNAs  (mRNAที่ใช้สังเคราะห์ >1 polypeptide) มี spacer regions ไว้กั้นระหว่าง polypeptides      และที่ปลาย  3’ – end ของ mRNA จะเป็น non‑translated trailer

·       mRNA ถูกสังเคราะห์จาก DNA template โดย RNA polymerase ใน E. coli สามารถพบ RNA polymerase ได้ถึง 7,000 โมเลกุล       การทำงานของ RNA polymerase จะคล้าย ๆ กับ DNA polymerase แต่จะใช้ ATP, GTP, CTP และ UTP ที่มี ribose (ในDNA เป็น deoxyribose) เป็นองค์ประกอบใน nucleotides ในการสังเคราะห์ mRNA

สมการ: 

 n[ATP, GTP, CTP, UTP] -----with RNA polymerase & DNA template----> RNA + nPPi

   

·       การสังเคราะห์ RNA จะเป็นไปในทิศทาง    5’ ® 3’ (ของสายใหม่) ใน E. coli ด้วยความเร็วประมาณ 40 nucleotides ต่อ 1 วินาที ที่ 37°C

·       RNA polymerase จะประกอบด้วย โปรตีน 5 subunits คือ a₂ (alpha two), b (beta), b^’  (beta prime) และ s (sigma)      ซึ่งส่วนประกอบที่เป็น a₂ ,b , b^’  จะเรียกว่าเป็น core enzyme ทำหน้าที่เป็นตัวคาตาไลต์ (catalyst) สังเคราะห์ RNA        ส่วน sigma factor (s) ทำหน้าที่ช่วยจดจำบริเวณ start site ในการสังเคราะห์ RNA      และถ้า s factors ต่างชนิดกัน ® ลำดับเบสของ promoter จะต่างกัน              ใน E. coli sigma factor จะเป็นชนิด s⁷⁰(70,000 kDa)

2.1 Initiation and Elongation of Transcription

·       บริเวณที่ RNA polymerase จับบนสาย DNA เรียกว่า promoter ซึ่งอยู่หน้า transcription starting point ประมาณ 10 bp โดยมีลำดับเบส (ใน E. coli)เป็น TATAAT (หรือเรียกว่า -10 region หรือ Pribnow box) และ TTGACA (-35  region)

  

·       เมื่อ RNA polymerase จับสาย DNA ที่บริเวณ promoter จะคลายเกลียว (unwind) สาย DNA บริเวณ Pribnow box       และการจับสาย DNA ของ RNA polymerase ยังช่วยให้สาย DNA ไม่ถูกย่อยจาก endonuclease ด้วย      หลังจากนั้น RNA polymerase จะเริ่มกระบวนการสังเคราะห์ RNA (s factor ก็จะหลุดออก RNA polymerase ในช่วงนี้) จาก start site (ซึ่งมักมีลำดับ nucleotide ตัวแลกเป็น A หรือ G)     และเนื่องจากว่า หมู่ phosphate จะไม่ถูกตัดออกไปที่ปลาย 5’-end ของ mRNA ดังนั้น procaryotic mRNA จึงมี triphosphate ติดอยู่ที่ 5’-end

2.2 Regulation of mRNA synthesis

2.2.1        Induction and repression

·       enzymes ที่สร้างจาก lac operon สามารถถูก induced และ repressed โดย lactose หรือ lactose analogue (isopropyl-b-D – thiogalactoside : IPTG) หรืออีกตัวคือ allolactose ซึ่งเรียกสารทั้งสองชนิดนี้ได้ว่าเป็น ตัวเหนี่ยวนำ หรือ inducers     

      ·       เราเรียกได้ว่า enzyme b- galactosidase เป็น inducible enzyme

·       เอนไซม์ที่สามารถ reduced โดย end product เรียกว่า repressible enzyme และ สาร metabolites ที่ทำใน repressible enzymes มีปริมาณลดลงเรียกว่า corepressors              

  

2.2.2        Negative control

ทั้ง induction และ repression เป็นรูปแบบของ negative control นั่นคือ การสังเคราะห์ mRNA จะดำเนินไปได้เร็วกว่าถ้าไม่มีปัจจัยควบคุม (controlling factor)

ตัวอย่างของ negative control เช่นใน lac operon ซึ่งจะถูกควบคุมโดย lactose repressor โดยที่ lactose repressor จะไปจับที่ operator ของ lac operon ทำให้ขัดขวางการเข้ามาจับของ RNA polymerase ที่ promoter site ยับยั้ง transcription

  

2.2.3        Positive control

ในทางตรงกันข้ามกับ negative control มีบาง operon ที่สามารถทำงานได้เมื่อมีปัจจัยควบคุม (controlling factor) เรียกการทำงานแบบนี้ว่า positive operon control และใน lac operon ก็มีการควบคุมแบบนี้ (lac operon ถูกควบคุมได้ทั้ง  negative และ positive control)

positive control ของ lac  operon ควบคุมโดย catabolite activator protein (CAP) และ 3’,5’-cyclix adenosine monophosphate (CAMP) (fig 12.26) และ lac repressor protein ด้วย ที่ lac promoter มี CAP site (ให้ CAP มาจับ) ซึ่ง CAP จะต้องเข้ามาจับก่อนที่ RNA polymerase เข้ามาจับที่ promoter เพื่อทำการ transcription (fig 10-9) และการที่ cAMP- CAP ที่ CAP site จะทำให้งอสาย DNA เป็นมุม 90°                  หลังจากนั้น RNA polymerase จึงเข้ามาจับ ® ทำให้เกิดการ transcription 

การจับของ cAMP-CAP และ RNA polymerase ที่ lac control region นี้จะทำให้เกิดการกระตุ้นการจับของกันและกัน  ต่อสาย mRNA ให้แน่นขึ้น เรียกว่าเป็น cooperativity และถ้า CAMP-CAP หรือ RNA polymerase จับสาย mRNA เพียงตัวเดียวจะมี affinity การจับต่ำกว่าการจับพร้อมกัน

สรุปแล้วใน positive control ที่กระตุ้นการทำงานของ lac operon นั้นขึ้นอยู่กับ 2 ปัจจัยหลักคือ การมี cAMP และ lactose

2.2.4        Attenuation

·       Rho- dependent terminator พบใน l- phage (สังเคราะห์ Cro-DNA binding protein ที่เหี่ยวนำ lytic pathway

·       Rho-independent termination มี Rho-independent termination sites ซึ่งมี 2 ลักษณะคือ 1) poly U ตามหลัง 2) GC-rich self –complementary region ซึ่งสามารถฟอร์มเป็น stem-loop ซึ่งจะทำให้หยุดการทำงานของ RNA polymerase 

·       Premature termination by attenuation

ใน trp operon มี attenuator site ซึ่งอยู่ในตำแหน่ง down-stream จาก promoter – operator region ก่อน structural genes ของ trp operon เรียกว่าเป็น leader sequence (L)  มีความยาว 165 nucleotides จาก AUG start codon ของ E . coli gene (บน trp operon)

จากการศึกษาพบว่า E. coli ปกติ เมื่อมี tryptophan ในการเจริญจะมีการสังเคราะห์ leader RNA เท่านั้นส่วนที่เหลือของ trp operon จะไม่ถูก transcribed แต่พอเมื่อ tryptophan มีน้อยลง    ทั้ง leader sequence และ trp operon จะถูก transcribed       ทั้งนี้เกิดจากที่ trp leader RNA มี 4 regions ที่สามารถเกิดเป็น stem-loop structures และ 1ในจำนวนนี้ทำให้เกิด attenuation คือ

1.      high tryptophan ทำให้เกิดการฟอร์มของ the 3-4 stem-loop ที่ trp leader RNA ที่มี    poly U เป็นหาง ทำให้เกิดการ termination แบบ Rho-independent

2.      low trptophan เนื่องจากว่า region 1 ของ trp leader RNA มี tryptophan codons อยู่-หลาย codons      ดังนั้นเมื่อ E. coli ขาดกรดอะมิโน trptophan จึงทำให้ขาด       Trp– tRNA^Trp ที่จ่ายเข้ามาใน ribosome      ทำให้ ribosome หยุดที่ region 1 ของ trp leader RNA นี้

ในทางกลับกันถ้า tryptophan เพียงพอในเซลล์       ribosome จะเคลื่อนผ่าน region 1   ไป   region 2    เกิดการฟอร์ม 3-4 stem-loop       ดังนั้นจึงทำให้เกิดการฟอร์มของ 2-3 stem-loop ทำให้ region 3 ไม่สามารถ complement กับ region 4 ได้        และทำให้กระบวนการ transcription ของ trp operon เกิดขึ้นต่อทำให้สังเคราะห์ยีน EDCAB บน trp operon   เพื่อใช้สังเคราะห์ tryptophan ต่อไป  

___________________________________________________________________