แบคทีเรียที่มีเปอร์เซ็น G+C ต่ำและเป็นแบคทีเรียแกรมบวก

แบคทีเรียที่มีเปอร์เซ็น G+C ต่ำและเป็นแบคทีเรียแกรมบวก

Bacteria : The Low  G+C Gram Positives

·     The  low  G+C Gram – positive  bacteria  จัดอยู่ใน phylum Firmicutes  มี 3 Classes คือ   

1. Clostridia     (หัวข้อที่ 3.)

2. Mollicutes    (หัวข้อที่ 1.)

3. Bacilli          (หัวข้อที่ 4.)

  

หัวข้อที่ 1. Class  Mollicutes  (Mycoplasmas)

·      มี 5 orders และแยกเป็น 6 families 

·      orders  ที่ถูกศึกษามากคือ Mycoplasmatales (Entomoplasma ,  Mesoplasma  , Spiroplasma) , Acholeplasmatales (Acholeplasma), และ Anaeroplasmatales (Anaeroplasma,Asteroleplasma)

·       สมาชิกใน Class  Mollicutes มักจะถูกจะเรียกว่า Mycoplasma

·    ไม่มี Cell wall  เนื่องจากว่าไม่สามารถสังเคราะห์ peptidoglycan  precursors ได้

·       มีเฉพาะ plasma  membrane เท่านั้น  ดังนั้นจึงมีรูปร่างได้หลายแบบ มีเส้นผ่าศูนย์กลาง 0.3 –0.8 mm มีลักษณะตั้งแต่รูปร่างคล้ายลูกแพร์ หรือ Flask (ซึ่งช่วยในการเกาะกับ eucaryotic  cells) จนถึง เป็นแบบ helical  filaments

·      เป็นแบคทีเรียที่เล็กที่สุด  ส่วนมากเป็น nonmotile บางชนิด  สามารถ glide ได้

·      ต้องการ sterols ในการเจริญเติบโต

·        ส่วนมากเป็น facultative  anaerobes  บางชนิดเป็น obligate  anaerobes

·         ลักษณะโคโลนีบนอาหารวุ้น  เป็นแบบ fried – egg  appearance  คือ โคโลนีตรงกลางจะเจริญลงไปใน agar  ส่วนวงรอบจะเจริญบนผิว agar

·      genome  มีขนาดเล็กมากๆ ประมาณ 5-10 ´10 ⁸  daltons

·        G+C  content  23-41 %

·         Mycoplasma  genitalium  พาราไซท์ใน genital  และ ท่อทางเดินหายใจ มี genome  ขนาด 580 kb = 482 genes

·         Mycoplasmas  ต้องการ sterols  ซึ่งถูกใช้ไปประกอบใน plasma membrane  membrane  sterols  นี้อาจช่วยให้มีการ osmosis ที่คงตัว

·        ไม่มี TCA Cycle  ที่สมบูรณ์

·      บางชนิดสร้าง ATP จาก Embden – Meyerhof  pathway และ lactic  acid  fermentation     บางชนิดสามารถ metabolize  arginine  หรือ urea เพื่อสร้าง ATP

·      สามารถ isolate  ได้จาก สัตว์ พืช ดิน หรือ ซากที่เน่าเปื่อยต่างๆ

·          10 %  mammalian  cell  culture   ในห้องทดลอง  อาจมีการ contaminate  ของ mycoplasma ด้วย  ซึ่งจะ interfere  การทดลอง พวกนี้จะตรวจสอบและกำจัดยาก

·          M.  pneumoniae  ทำให้เกิด atypical  pneumonia ในมนุษย์     genome  ของมันถูก sequence พบว่า pathways of  amino  acid biosynthesis  ไม่มี    แสดงว่าเป็น  parasitic  lifestyle

·     นอกจากนี้แล้วพบว่า mycolasmas  ยังทำให้เกิดโรคที่เกี่ยวกับทางเดินหายใจใน วัว หมู และไก่อีกด้วย เช่น

M.  mycoides           ®    contagious  bovine  pleuropneumonia  ในวัว

M. gallisepticum     ®     chronic  respiratory  disease    ในวัว

M.   hyopnemoniae ®     pneumonia       ในหมู

·       spiroplasmas  พบใน  แมลง และพืชต่างๆด้วย

หัวข้อที่ 2. Low  G+C Gram – positive  bacteria  in  Bergey’s  Manual

·   ถูกจัดอยู่ในพวก 1) Gram – positive  cocci, 2) Endospore  forming  gram  positive  rods and  cocci  และ 3) Regular, non  sporing  gram – positive  rods ซึ่งการจำแนกในการตีพิมพ์ครั้งแรกนี้ได้จากการสังเกต  phenotypes  เช่น รูปร่างมี endospore,  การใช้ O₂,   peptidoglycan  chemistry และอื่นๆ

·          peptidoglycan  structure  เป็นโครงสร้างที่สำคัญที่ใช้จำแนกแบคทีเรียในกลุ่มนี้

-          Gram – negative  bacteria  ส่วนมากมี meso- DAP (diaminopimelic  acid) ตำแหน่งที่ 3 มีพันธะกับ C – terminus ของ D-alanine  ของ peptide  chain  ที่ติดกัน  ซึ่งโครงสร้างอันนี้ก็สามารถพบใน Gram – positive  genera พวก Bacillus  ,Clostridium , Lactobacillus , Corynebacterium , Mycobacterium และ Nocardia ด้วย

-          Gram – positive  bacteria  อื่น จะไม่มี meso – DAP ในตำแหน่งที่ 3 แต่จะมี L- Lysine แทน และมี interpeptide  bridge ซึ่งประกอบด้วย monocarboxylic  L- amino  acids หรือ glycine หรือทั้งคู่

-          Streptomyces และพวก actinobacterial  genera มี L-L,diaminopimelic acid ในตำแหน่งที่ 3 แทนที่ meso-DAP และมี interpeptide  bridge เป็น glycine  1 ตัว

-          ในพวก plant  pathogenic  corynebacteria  บางชนิดมี interpeptide  bridge เชื่อมระหว่างตำแหน่ง 2 กับ 4 ของ peptidesubunits ไม่ใช่ตำแหน่ง 3 กับ 4  เหมือนแบคทีเรียตัวอื่น

-          Bacilli  และ Gram – negativec  bacteria  ส่วนมากมีพันธะที่ต่อระหว่าง muramic  acid  กับ peptide  อื่นน้อยกว่า  Gram – positive bacteria เช่น Staphylococcus  aureus ซึ่ง muramic acid  ทุกตัวต่อกับ peptide อื่น

·         Bacterial  endospore      เป็นอีกโครงสร้างหนึ่งที่สำคัญในการจำแนกแบคทีเรียในกลุ่ม    Gram – positive  bacteria

-          กลมหรือรูปไข่  มี spore  coat  และ inner  spore  membrane

-          ประกอบด้วย dipicolinic  acid  ซึ่งทนต่อความร้อน        spore  นี้สามารถ อยู่ในระยะพักได้นาน         endospore  ของ  Bacillus  sphaericus มีชีวิตอยู่ได้นานถึง 25 ล้านปี !!!

-          การตรวจสอบสปอร์ spore staining  หรือ โดยให้ความร้อนที่ 70-80 C, 10 นาทีแล้วนำไปเพาะบนอาหารเลี้ยงเชื้อ (เนื่องจาก endospores และ thermophiles เท่านั้นที่จะอยู่รอดที่ความร้อนเท่านี้)

·      ใน Bergey’s manual  เล่มใหม่  จัด  low G+C  Gram-positive  bacteria  เป็น 2 classes คือ

            1.  Clostridia     

   และ  2.   Bacilli

หัวข้อที่ 3. Class   Clostridia

·        มี 3 order  , 11  families 

·          จีนัสที่ใหญ่ที่สุด  คือ Clostridium  มีมากกว่า 100 สปีชีส์

·          Clodtidium  เป็น anaerobic และมี endospore ที่ทนทานต่อความร้อน  Clostidium นี้จะพบมากในอาหารที่เสีย  รวมถึง อาหารกระป๋องที่เสียๆด้วย  C. botulinum   ทำให้เกิด botulism 

·          Clostidium  สามารถ ferment  กรดอะมิโน เพื่อสร้าง ATP  โดยจะออกซิไดส์กรดอะมิโนตัวหนึ่งแล้วใช้อีกตัวหนึ่งเป็น electron  aceceptor  กระบวนการนี้เรียกว่า          Stickland  reaction  ในกระบวนการนี้จะได้ ammonia , hydrogen  sulfide , fatty  acids และ amines  ระหว่างการ ferment  proteins  สารเหล่านี้มีกลิ่นที่แรง

C. tetani    ทำให้เกิด tetanus /  C. perfringens  ®gas  gang rene และอาหารเป็นพิษ  / C. acetobutylicum     ใช้  ผลิต butanol

·          จีนัสอื่นที่น่าสนใจ  เช่น  Desulfotomaculum  ® anaerobic  endospore  - forming  genus   สามารถรีดิวซ์  sulfate  และ sulfite ให้เป็น hydrogen  sulfide  ระหว่าง anaerobic  respiration

Desulfotomaculum  มี cell wall แบบ  Gram – positives  แต่ย้อมสีติดแบบ Gram – negatives

·          Heliobacteria ®  genera  Helisbacterium กับ Heliophilum  เป็น  anaerobic  photosynthetic  bacteria  มี chlorophyll เป็น bacteriochlorophyll g มี photosystem  type I   มี   reaction  center  คล้ายกับ green  sulfer  bacteria  แต่ไม่มี intracytoplasmic  photosynthetic  membranes ซึ่งมี  pigment  s  อยู่ใน plasma  membrane  คล้ายกับ  Desulfotomaculum  ตรงที่ย้อมติดสี Gram – negatives  แม้ว่าจะมี cell  wall เป็นแบบ Gram – positive   cell  wall  มีปริมาณ  peptidoglycan  ต่ำ  และ heliobacteria  บางชนิดสร้าง andospores

·          genus  Veillonella      Bergey’s  เล่มเก่าจัดอยู่ใน  anaerobic  Gram- negative   cocci

-          อยู่ใน family  Veillonellaceae  เป็น anaerobic  , chemoheterotrophic  cocci  ขนาดเส้นผ่าศูนย์กลาง 0.3 – 2.5 mm ปกติจะพบเป็น diplococi (ด้านที่ติดกันจะแบน) แต่สามารถพบเห็นเป็นเซลล์เดี่ยวๆ กลุ่มหรือโซ่ต่อกัน

-          สามารถใช้ carbohydrates , lactate , organic  acids  และใช้ amino  acids ในการผลิตก๊าซ CO₂ และ H₂ 

-          พวกนี้จะเป็น parasites ใน homeothermic  animals (สัตว์เลือดอุ่น)

-          Veillonella มีมากที่ tongue surface และที่ฟันของคน  และยังสามารถ isolate ได้จาก vagina    Veillonella สามารถปรับตัวได้ดีในช่องปาก เพราะมันสามารถใช้ lactic acid  ซึ่งได้จาก การย่อย carbohydrates  ของ sterptococi และแบคทีเรียในช่องปากตัวอื่นได้

หัวข้อที่ 4. Class  Bacilli

          มี 2 order  , 16 families  , ประมาณ 59 genera  ซึ่งในที่นี้จะพูดถึง 2 order  หลักๆคือ Bacillales กับ Lactobacillales

4.1 Order  Bacillales

·          family  ที่ใหญ่ที่สุดคือ Bacillaceae ® genus  Bacillus

·          Bacillus  genes  เป็น Gram – positive  , endospore – forming , chemoheterotrophic  rods  ซึ่งสามารถเคลื่อนไหวได้และมี flagella

·          เป็น aerobic  บางครั้งเป็น facultative  ได้  และ catalase  positive

·          ในการตีพิมพ์หนังสือของ Bergey’s ครั้งที่ 2 มี genera  แบ่งออกมาอีก 2 อันคือ

- Alicyclobacillus เป็นพวก acidophilic , sporing , gram – positive หรือ gram – variable rods  ซึ่งมี w – alicylic   fatty  acids ที่มี 6 หรือ 7 – carbon  rings อยู่ที่ membrane  เป็น aerobic  หรือ facultative  G+C content 51-60 %

- Paenibacillus  [ Latin  paene  = almost , and  bacillus] เป็น Gram – positive  rods เคลื่อนไหวโดย peritrichous flagella มี ellipsoidal  endospores  และ sporangia ที่บวม  สร้างกรดหรือ gas ได้จากการย่อยสลาย glucose หรือน้ำตาลตัวอื่น  G+C  content 40-54  %   เช่น Paenibacillus  alvei . P. macerans และ P. polymyxa

·          Bacilluc  subtilis  มี genome  = 4.2 ล้าน bp มี ABC  transporters อยู่มาก มียีนที่ใช้ใน catabalism ของ diverse  carbon  sources มียีนที่ใช้สังเคราะห์ antibiotic และมี DNA จาก bacteriophage อย่างน้อย 10 prophages

·         Bacillus  สร้างยาปฏิชีวนะ  เช่น bacitracin , gramicidin และ polymyxin

B. cereus   ®      food  poisoning  และสามารถ infect  humans

B. antracis ®      antirax   ในคนและสัตว์

B.  sphaericus ® มี solid  protein  crystal  เรียกว่า   parasporal  body   

ใกล้กับ  spores ระหว่างการสร้าง endospore

B. thuringiensis ® มี parasporal  body  ที่เป็นพิษ ฆ่า moth ได้มากกว่า 100 ชนิด          สารพิษนี้ทำลาย  gut  epithelium      ส่วนมาก toxin  gene  จะอยู่บน  plasmid  B. sphaeroicus  มีโปรตีนที่ toxic ต่อลูกน้ำของยุง  

·         Genus  Thermoactinomyces เป็น thermophilic  เจริญที่อุณหภูมิ 45-60 ° C

      สร้างสปอร์ทิ้งใน aerial และ substrate  mycelia

     มักจะพบตามกองฟางที่ชื้น  กองขยะที่เน่าเปื่อย  และที่ที่มีอุณหภูมิสูงๆ    

     สปอร์ของ Thermoactinomyces เป็น endospores ซึ่งทนต่อความร้อนสูง

    ซึ่งสามารถอยู่รอดที่อุณหภูมิ 90 ° C  ถึง 30 นาที   endospore นี้จะฟอร์มที่

     hyphae ภายในมี calcium และ dipicolinic acid   Thermoactinomyces 

     vulgaris  พบในกองฟาง   โรงนาที่ใช้เก็บเมล็ดพืช 

     เป็นตัวทำให้เกิดโรคภูมิแพ้ในระบบหายใจในเกษตรกรนี้     

     เร็วๆนี้มีการค้นพบสปอร์ของ T. vulgaris ในโคลนของทะเลสาบ Minnesota  

     ซึ่งอยู่มากว่า 7,500 ปี

·          Genus  Caryophanon เป็น strictly  anaerobic  Gram positive  bacteria  , catalase  positive  และเคลื่อนไหวได้ด้วย peritrichous  flagella  ในธรรมชาติพบที่มูลของวัว  มีลักษณะเซลล์เป็น disk – shaped  (1.5 – 20 mm ´ 0.5 – 1.0 mm ) เกาะกันเป็นตั้งๆ จนเป็นรูป rods ยาว 10-20   mm

 ·          family  Staphylococcaceae มี 4 genera  genus  ที่สำคัญคือ Staphylococcus ซึ่งเป็น facultatively  anaerobic  ,nonmotile, Gram – positive  cocci  ,มักจะฟอร์มเป็นพวงองุ่น ,catalase  positive , oxidase  negative  , ferment  glucose  , มี  teichoic  acid ในโครงสร้างของ cell walls  Staphylococci  มักพบที่ผิวหนัง เยื่อหุ้มเมมเบรนในสัตว์เลือดอุ่น Staphylococcus  epidermidis           ติดเชื้อในแผลเป็นจากการผ่าตัด ท่อปัสสาวะ   S. aureus  เป็น pathogen  ที่สำคัญต่อคน      แผลหนอง แผลติดเชื้อ   pneumonia, toxic  shock  syndrome  และ โรคอื่นๆ  S. aureus  เป็นเชื้อดื้อยา (multidrug  resistance) รักษาค่อนข้างยาก

S. aureus  สร้างเอนไซม์  coagulase ซึ่งทำให้  blood  plasma  แข็งตัว

·          Listeria, family  Listeriaceae  เป็นจีนัสหนึ่งที่สำคัญทางการแพทย์เป็น short  rods , aerobic หรือ facultative  , catalase  positive  และ motile โดย peritrichous  flagella  พบมากใน ซากสิ่งเน่าเปื่อย Listeria  monocytogenes เป็น pathogen  ในคนและสัตว์และทำให้เกิดโรค listeriosis  ; food  infection

4.2      Order  Lactobacillales

·          สมาชิกของ  order  Lactobacillales  หลายๆ ตัวสร้าง lactic  acid  ซึ่งเป็นสารหลักของ fermentation  product  แบคทีเรียนี้จึงถูกเรียกว่า lactic  acid  bacteria

·          สมาชิกในกลุ่มนี้เช่น  Streptococcus  , Enterococcus ,Lactococcus , Lactobacillus  และ Leuconostoc 

·          เป็น nonsporing , nonmotile ไม่มี  cytochromes ซึ่งจะได้พลังงานจาก substrate  level  phorphorylation  แทนที่จะเป็นจาก electron   transport และ oxidation  phosphorylation และ lactobacillales นี้จำเป็นต้องใช้ sugar ใน fermantation  เพื่อให้ได้พลังงาน เป็นพวกที่เลือกกันและจำเป็นต้องใช้ vitamins , amine acids , purines  และ pyrimidines ในการเจริญเติบโต เนื่องจากมีความสามารถของ biosynthetic  ที่จำกัด  lactic  acid  bacteria  มักจะถูกจำแนกเป็น  facultative  anaerobes  บางตำราจัดแบคทีเรียกลุ่มนี้เป็น  aerotolerant  anaerobes 

·          genus  ที่ใหญ่ที่สุดใน order  นี้คือ Lactobacillus ซึ่งมีเกือบ 80 species 

-          Lactobacillus  ประกอบด้วยพวก non  sporing rods และ coccobacilli ซึ่งเป็น catalase  negative  และไม่มี Cytochromes เป็น  facultative  หรือ microaerophilic  สร้าง lactic  acid  เป็นผลิตภัณฑ์หลักหรือผลิตภัณฑ์เดียวของ fermentation  ต้องการสารอาหารหลายอย่างมากในการเจริญ

-          Lactobacilli  ใช้ Embden-Meyerhof  pathway (glycolysis) = homolactic  fermentation หรือใช้ pentose  phosphate  pathway  = heterolactic  fermentation โตที่ pH 4.5 – 6.4  Lactobacillus  พบที่บริเวณผิวพืช  ผลิตภัณฑ์นม, เนื้อ ,น้ำ ,น้ำในท่อระบาย,  เบียร์, ผลไม้ และยังพบในช่องปากของคน, ลำไส้และ vagina  แต่โดยปกติแล้วจะไม่ใช่ pathogen 

-          Lactobacillus  ใช้ในผลิตภัณฑ์พวกผักดอง, เบียร์, ไวน์, น้ำผลไม้, ชีส, โยเกิต และไส้กรอก 

โยเกิต ทำจาก nonfat  หรือ low- fat  milk  ที่ผ่านการฆ่าเชื้อโดย pasterrization  แล้วทำให้เย็นที่ 43 °C  หรือต่ำกว่า  เติมด้วย Streptococcus  thermophilus  และLactobacillus  bulgaricus   S. thermophilus  จะโตในช่วงแรกอย่างรวดเร็ว  ทำให้นมเป็น anerobic  และ   มีความเป็นกรดเล็กน้อย จากนั้น L . bulgaricus  ทำให้นมมีความเป็นกรดมากขึ้น การทำงานของทั้ง 2  species  ทำให้ lactose ถูกเปลี่ยนเป็น lactic acid  และให้รสของโยเกิตด้วย  diacetyl  (S. thermophilus) และ acetaldehyde ( L.bulgaricus) ผลไม้และรสผลไม้จะเป็นส่วนผสมที่ใส่เข้าไปทีหลัง

-          Lactobacillus บางครั้งทำให้เกิด เบียร์ นม หรือ เนื้อสัตว์เสีย เนื่องจาก end 

Products จากเมตโบลิซึมของมันทำให้เกิดกลิ่นหรือรสที่ไม่ปรารถนา

·        Leuconostoc,  family  Leuconostocaceae ประกอบด้วย facultative  Gram-positive  cocci   ซึ่งสามารถยาวขึ้นหรือเป็นรูป elliptical  และมีการจัดเรียงตัวเป็นคู่หรือต่อกันเป็นโซ่

-          เป็น calalase  negative  ไม่มี  cytochromes และใช้ heterolactic  fermentation  เท่านั้น ซึ่งจะเปลี่ยน glucose  เป็น D – lactate และ ethanol  หรือ acetic  acid โดยใช้  phosphoketolase  pathway 

-          สามารถแยกได้จากพืช นม  จีนัสนี้ใช้ในการผลิตไวน์  การหมักดอกผักทำ buttermilk , butter  และ cheese        L. mesenteroides ใช้สังเคราะห์ dextrans จาก sucrose และอยู่ในที่ที่มีความเข้มข้นของน้ำตาลสูงๆได้ ดังนั้นจึงสามารถโตได้ใน syrup และเป็นปัญหาในอุตสาหกรรมการผลิตน้ำตาล

·       ที่อีก families ที่สำคัญ ใน order นี้คือ Enterococcaceae (Enterococcus) และ sterptococcaceae ( Streptococcus, Lactococcus) ซึ่งเป็น chemohetherotrophic , mesophilic , nonsporing, gram- positive  cocci      genus ที่สำคัญคือ Streptococcus ซึ่งเป็น facultatively anaerobic  และ catalase negative

-          Streptococci มีความใกล้ชิดกับแบคทีเรียในกลุ่ม Enterococci  และ Lactococci จะปรากฏเป็นคู่หรือสายเมื่อเลี้ยงให้ liquid  media  ไม่มี  endospores และส่วนมากจะเป็น nonmotile จีนัสนี้เป็น chemoheterotrophs ที่ ferment  sugars ได้ lactic acid  แต่ไม่มีก๊าซเกิดขึ้น โดยใช้ homolactic  fermentation

-          Streptococci  จะมีลักษณะหลายๆอย่างคล้าย Enterococci และ Lactococci

-          วิธีที่ใช้จำแนกแบคทีเรียใน 3 กลุ่ม  นี้คือ ความสามารถในการ lyse  เม็ดเลือดแดง ในขณะที่โตบน  blood  agar (มี 5% sheep หรือ horse blood )

-          a - hemolysis = 1-3 mm  zone สีเขียว เกิดจาก   incomplete  hemolysis  รอบๆ streptococcal  colony

-          b - hemolysis  = clear  zone  หรือ complete  lysis 

-          การตรวจสอบด้วยวิธีตรวจหา antigen  จาก cell wall ของ streptococci  ซึ่งจะพบ  polysaccharide และ  teichoic  acid  antigens ที่ wall  และ plasma  membrane เรียกการตรวจวิธีว่าเป็น Lancefield  grouping system

-          สมาชิกของกลุ่ม streptococci , enterococci  และ lactococci ที่สำคัญเช่น Streptococcus  pyogenes (pyogenic = pus  producing)ทำให้เกิดเจ็บคอ , acute  glomerulonephritis และ rheumatic  fever 

              S. pneumoniae  เป็น a - hemolytic  พบเป็นคู่ cocci ทำให้เกิด pneumonia และ otitis media (ติดเชื้อของหูชิ้นกลาง)

              S. mutans  ทำให้ฟันผุ  E. faecalis พบในลำใส้ของคนเรา ซึ่งจะทำให้เกิดโรคตามโอกาสคือโรค urinary  tract infections และ endocarditis  enterococci ต่างกับ streptococci  ตรงที่มันสามารถเจริญได้ใน NaCl 6.5 % lactococci  สามารถ ferment  sugars ได้ lactic  acid และสามารถโตได้ที่ 10 °C แต่โตไม่ได้ที่ 45 °C     L. Lactis ใช้ในการทำ  buttermilk และ cheese ซึ่งสามารถสร้างสารให้รส พวก diacetyl  และสารอื่นๆได้ 

 -----------------------------------------------------------

การแปลรหัสพันธุกรรมเพื่อสังเคราะ์โปรตีน (translation: protein synthesis)

การแปลรหัสพันธุกรรมเพื่อสังเคราะ์โปรตีน 

(translation: protein synthesis)

·       a protein ประกอบด้วย  ³ 1 subunits ของโพลีเปปไทด์ (polypeptides)

·       polypeptides ประกอบจาก amino acids ต่อๆกันด้วย peptide bond

·       โครงสร้างของโปรตีนมี 4 ระดับ คือ

1.      primary structure

2.      secondary structure

3.      tertiary structure

4.      quaternary structure

·       The genetic code is a triplet code  (เช่น CAU และ CAC เป็นพันธุกรรมของ histidine)

·       Transfer  RNAs  (tRNAs)

      tRNAs เป็น single-stranded  RNA  ยาวประมาณ 74-95  nucleotides ประกอบด้วย A,G,C และ U nucleotides     tRNA แต่ละตัวจะทำหน้าที่ขนส่งกรดอะมิโนที่เฉพาะชนิด  เช่น  tRNA^gly จะทำหน้าที่ขนส่ง amino acid glycine

tRNA มีส่วนที่สำคัญ 2 ส่วนคือ 1) amino acid attachment site 2) anticodon = 3 nucleotides complementary to an mRNA codon specifying the amino acid carried by the tRNA (เช่น  anticodon เป็น 3’-CCU-5’ จะ complement       กับ mRNA codon  ที่เป็น 5’-GGA-3’  และ tRNA นั้นจะทำหน้าที่ขนส่ง glycine ) tRNA จะต่อกับ amino acid  ด้วยเอนไซม์เฉพาะชื่อ aminoacyl-tRNA synthetase เอนไซม์นี้จะเฉพาะมากคือ จะมี aminoacyl-tRNA synthetase  อย่างน้อย 1 ตัว ต่อ 1 amino acid        tRNA ที่มี amino acid เกาะติดอยู่เรียกว่า charged tRNA

                                               Mg2+

            Amino acid + tRNA + ATP    ®    aminoacyl–tRNA + AMP+PPi

  

·       ไรโบโซม (ribosome)

procaryotic ribosome ประกอบด้วย 30S และ 50S subunit  แต่ละ subunit ประกอบด้วย 1-2 rRNA molecules และ polypeptides            พื้นที่เป็นส่วนที่รับผิดชอบในกระบวนการ translation บน ribosome เรียกว่า translation domain      สายโปรตีนที่ยาวขึ้นจากการ translation จะออกมาตรงส่วนที่เรียกว่า exit domain ของ ribosome

small 30S subunit จะจับกับ mRNA    ส่วน 50S subunit จะทำหน้าที่เป็นเอนไซม์ peptidyl transferase (23S rRNA is the enzyme) คอยเชื่อม peptide bonds ของ amino acids ให้ต่อกันใน ribosome จะมีส่วนที่เรียกว่า peptidyl site (P site), exit site (E site)    และ aminoacyl site (A site)

1.      Initiation of translation

การสังเคราะห์โปรตีน สามารถแบ่งได้เป็น 3 ขั้นตอนคือ

1.      initiation

2.      elongation

3.      termination

ในขั้นแรกของ initiation ใน E. coli และ แบคทีเรียส่วนมาก AUG codon จะเป็น start codon สำหรับ N- formylmethionyl-tRNA^fmet  (f Met-tRNA)       (เนื่องจากว่า a- amino ถูกจับด้วย formyl group         aminoacyl-tRNA ตัวนี้จึงใช้เป็นตัวแรกในขั้น initiation เท่านั้น    แต่หลังจากการสังเคราะห์โปรตีนเสร็จ formyl group นี้จะถูกตัดออกไป)

กระบวนการ  initiation นั้นเริ่มจาก

1.      intiation factors ; IF1, IF2 และ IF3 จับกับ 30S subunit ของ ribosome เกิดเป็น preinitiation complex

2.      preinitiation complex จับกับ fmet-tRNA^met และ mRNA   (จับกับ mRNA โดย 16S rRNA มีลำดับที่ 3’-terminus นั้น complement กับ Shine Dalgarno sequence) และตำแหน่งของ  AUG (หรือ GUG) จะถูกบอกตำแหน่ง

3.      50 S subunit จะเข้ามาโดยที่ IF1 จะหลุดออกไป และ IF2-GTP จะถูก hydrolysed สุดท้ายจะได้เป็น 70S initiation complex           fmet-tRNA^met จะอยู่ที่ P site และ ribosomme ก็จะพร้อมสำหรับที่จะให้ aminoacyl-tRNA ตัวต่อไปเข้ามาที่ A site

-          initiation factor 3 (IF-3) ป้องกัน 30S subunit จับกับ 50 S subunit     และช่วยให้ mRNA จับกับ 30S subunit อย่างเหมาะสม

-          initiation factor2 (IF-2 ) จับกับ GTP และ fmet-tRNA    และช่วย fMet-tRNA จับกับ 30S subunit

-          initiation  factor1 (IF-1) จำเป็นเพื่อใช้ช่วยในการปลดปล่อย IF2 และ GDP จาก 70 S ribosome     และ IF1 ยังอาจจะช่วยในการจับของ 50S subunit กับ 30S subunit อีกครั้ง

  

2. Elongation of the Polypeptide Chain

elongation cycle เป็นกระบวนการต่อสายโพลีเปปไทด์ให้ยาวขึ้น ประกอบด้วย 3 ระยะ คือ

1. aminoacyl tRNA binding

2. transpeptidation reaction

3. translocation

ซึ่งทั้ง 3 ระยะนี้มี elongation factors ต่าง ๆ คอยช่วย        ในแต่ละรอบของ elongation cycle       amino acid 1 ตัว จะถูกนำมาต่อเข้าไปที่ C – terminal end ของ polypeptide chain

อย่างที่กล่าวไว้แล้วว่า ribosome มี 3 sites สำหรับ tRNAs คือ 1) P site 2) A site  และ 3) E site และใน initiation transcription fMet–tRNA^met อยู่ใน P site (AUG codon for fMet –tRNA^met )   ต่อจากนั้นกระบวนการ elongation จะเป็นดังนี้คือ

1. aminoacyl-tRNA binding phase    aminoacyl-tRNA ที่มี anticodon จับคู่ได้กับ codon ที่ 2   จาก AUG จะเข้ามาที่ A site โดยการนำพาของ GTP และ elongtion factor EF-Tu (เมื่อ GTP จับกับ EF-Tu จะทำให้ EF-Tu อยู่ใน active state และส่ง aminoacyl-tRNA เข้าไปที่ A site)    หลังจากนั้นจะเกิด GTP hydrolysis และ EF-Tu·GDP complex แยกออกมาจาก ribosome          จากนั้น EF-Tu·GDP จะถูกเปลี่ยนให้เป็น EF-Tu·GTP ด้วย elongation factor EF-Ts    แล้วจากนั้น aminoacyl–tRNA ก็จะมาจับกับ EF-Tu·GTP อีก

2. transpeptidation reaction    เมื่อ aminoacyl-tRNA เข้ามาอยู่ใน A site แล้ว    จะทำให้เกิดปฏิกิริยา transpeptidation reaction โดยมีเอนไซม์ peptidyl transferase (อยู่ใน 50S subunit) เป็นตัวคาตาไลท์ (catalyst) โดยที่ a- amino group ของ amino acid ที่ A site จะไปทำปฏิกิริยากับ a - carboxyl group ของ   C- terminal amino acid ที่ P site tRNA    แล้วดึง amino acid(s) นั้น มาอยู่ที่ A site

  

3. translocation    เป็นระยะสุดท้าย ของ elongation cycle ซึ่งมีเหตุการณ์ต่อไปนี้เกิดขึ้นพร้อม ๆ กัน

1)      peptidyl-tRNA ย้ายจาก A site ไปที่ P site

2)      ribosome เคลื่อนไปอีก 1 codon บนสาย mRNA ทำให้ a new codon อยู่ที่ A site

3)      tRNA ที่ไม่มี amino acid เกาะอยู่จะออกจาก P site ไปที่ E site แล้วจึง จาก ribosome ไป

ซึ่งในกระบวนการ translocation นี้มี EF-G (translocase protein) และ GTP hydrolysis เข้ามาร่วม               ในระหว่างการ translocation นี้ ribosome ก็มีการเปลี่ยนแปลงรูปร่างนิดหน่อย   ขณะที่เคลื่อนที่จาก 5’ ไป 3’-end ของ สาย mRNA

  

3. Termination of Translation

การสังเคราะห์โปรตีนสิ้นสุดเมื่อ ribosome เคลื่อนที่มาถึง nonsense codon : UAA,UAG หรือ UGA โดยที่มี release  factotors : RF-1, RF-2 และ RF-3 ช่วยทำให้ ribosome จดจำ codons เหล่านี้ได้       RF-1 และ RF-2 มีโครงสร้างคล้าย tRNA (molecular mimicry)  โดยที่ RF-1 จดจำ UAG ได้      ส่วน RF-2 จดจำ UGA ได้และทั้งคู่จดจำ UAA ได้     ส่วน RF-3 เป็น GTP- binding protein จะเข้าทำงานร่วมกับ RF-1 และ RF-2   โดยช่วยทำให้เกิดการตัด peptidyl-tRNA ทำให้ได้ protein chain หลุดออกมา   และ protein chain ที่หลุดออกมาจะถูก fold เป็น 3D conformation ด้วยโปรตีนที่เรียกว่า chaprones

หลังจากนั้น ribosome ก็จะแยกตัวออกมาจากสาย mRNA และแยกไปเป็น 30S และ 50S subunits          IF-3 จะจับกับ 30S subunit เพื่อป้องกันไม่ให้ 30S subunit มาจับกับ 50S subunit ได้อีกครั้ง จนกว่าจะถึงช่วงเวลาที่เหมาะสมหรือเข้าสู่ initiation stage อีกครั้ง

ในกระบวนการของ protein synthesis นี้ เป็นกระบวนการที่แพงมาก      เนื่องจากว่าใช้ 3 GTPs และ 2 ATPs ในการต่อ 1 amino acid เข้าไปที่สาย polypeptide chain

ribosomes ที่ในกระบวนการ protein synthesis ของ procaryotes และ eucaryotes นั้นต่างกัน

-          streptomycin binds to  30S ribosomal subunit ยับยั้งการสร้างโปรตีน และทำให้ 30S subunit อ่าน mRNA ผิด

-          erythromycin binds to 50S ribosomal subunit และยับยั้งกระบวนการ peptide chain elongation ในการสังเคราะห์โปรตีน 

การถอดรหัสดีเอ็นเอ (DNA Transcription)

การถอดรหัสดีเอ็นเอ (DNA Transcription)

              DNA  -----transcription--->   RNA   ----translation---->    Protein (polypeptide)

1.     บทนำ (Introduction)

RNA product ที่ได้จากกระบวนการ transcription จะมีลำดับเบส complementary กับดีเอ็นเอต้นแบบ (DNA template) กระบวนการ transcription เป็นกระบวนการที่ใช้สังเคราะห์ RNA ทั้ง 3 ชนิดคือ

1. messenger RNA (mRNA)           = อาร์เอนเอนำรหัสใน protein synthesis

2. transfer RNA (tRNA)                  = ผู้ขนส่งกรดอะมิโนในกระบวนการ protein synthesis

3. ribosomal RNA (rRNA)               = โมเลกุลที่เป็นองค์ประกอบของไรโบโซม

  

2.     กระบวนการถอดรหัสในโปรคาริโอต (Transcription in Procaryotes)

·       Prokaryotic mRNA เป็น single-stranded RNA มีความยาวขนาดต่าง ๆ กันไป            mRNA ของโปรคาริโอต มีส่วนที่ไม่ใช้ถอดรหัสเป็นโพลีเปปไทด์ (polypeptide) รวมอยู่ด้วยเรียกว่า nontranslated leader sequence ยาว 25-150 bp         และที่ปลาย 5’- end ของ mRNA และใน polygenic mRNAs  (mRNAที่ใช้สังเคราะห์ >1 polypeptide) มี spacer regions ไว้กั้นระหว่าง polypeptides      และที่ปลาย  3’ – end ของ mRNA จะเป็น non‑translated trailer

·       mRNA ถูกสังเคราะห์จาก DNA template โดย RNA polymerase ใน E. coli สามารถพบ RNA polymerase ได้ถึง 7,000 โมเลกุล       การทำงานของ RNA polymerase จะคล้าย ๆ กับ DNA polymerase แต่จะใช้ ATP, GTP, CTP และ UTP ที่มี ribose (ในDNA เป็น deoxyribose) เป็นองค์ประกอบใน nucleotides ในการสังเคราะห์ mRNA

สมการ: 

 n[ATP, GTP, CTP, UTP] -----with RNA polymerase & DNA template----> RNA + nPPi

   

·       การสังเคราะห์ RNA จะเป็นไปในทิศทาง    5’ ® 3’ (ของสายใหม่) ใน E. coli ด้วยความเร็วประมาณ 40 nucleotides ต่อ 1 วินาที ที่ 37°C

·       RNA polymerase จะประกอบด้วย โปรตีน 5 subunits คือ a₂ (alpha two), b (beta), b^’  (beta prime) และ s (sigma)      ซึ่งส่วนประกอบที่เป็น a₂ ,b , b^’  จะเรียกว่าเป็น core enzyme ทำหน้าที่เป็นตัวคาตาไลต์ (catalyst) สังเคราะห์ RNA        ส่วน sigma factor (s) ทำหน้าที่ช่วยจดจำบริเวณ start site ในการสังเคราะห์ RNA      และถ้า s factors ต่างชนิดกัน ® ลำดับเบสของ promoter จะต่างกัน              ใน E. coli sigma factor จะเป็นชนิด s⁷⁰(70,000 kDa)

2.1 Initiation and Elongation of Transcription

·       บริเวณที่ RNA polymerase จับบนสาย DNA เรียกว่า promoter ซึ่งอยู่หน้า transcription starting point ประมาณ 10 bp โดยมีลำดับเบส (ใน E. coli)เป็น TATAAT (หรือเรียกว่า -10 region หรือ Pribnow box) และ TTGACA (-35  region)

  

·       เมื่อ RNA polymerase จับสาย DNA ที่บริเวณ promoter จะคลายเกลียว (unwind) สาย DNA บริเวณ Pribnow box       และการจับสาย DNA ของ RNA polymerase ยังช่วยให้สาย DNA ไม่ถูกย่อยจาก endonuclease ด้วย      หลังจากนั้น RNA polymerase จะเริ่มกระบวนการสังเคราะห์ RNA (s factor ก็จะหลุดออก RNA polymerase ในช่วงนี้) จาก start site (ซึ่งมักมีลำดับ nucleotide ตัวแลกเป็น A หรือ G)     และเนื่องจากว่า หมู่ phosphate จะไม่ถูกตัดออกไปที่ปลาย 5’-end ของ mRNA ดังนั้น procaryotic mRNA จึงมี triphosphate ติดอยู่ที่ 5’-end

2.2 Regulation of mRNA synthesis

2.2.1        Induction and repression

·       enzymes ที่สร้างจาก lac operon สามารถถูก induced และ repressed โดย lactose หรือ lactose analogue (isopropyl-b-D – thiogalactoside : IPTG) หรืออีกตัวคือ allolactose ซึ่งเรียกสารทั้งสองชนิดนี้ได้ว่าเป็น ตัวเหนี่ยวนำ หรือ inducers     

      ·       เราเรียกได้ว่า enzyme b- galactosidase เป็น inducible enzyme

·       เอนไซม์ที่สามารถ reduced โดย end product เรียกว่า repressible enzyme และ สาร metabolites ที่ทำใน repressible enzymes มีปริมาณลดลงเรียกว่า corepressors              

  

2.2.2        Negative control

ทั้ง induction และ repression เป็นรูปแบบของ negative control นั่นคือ การสังเคราะห์ mRNA จะดำเนินไปได้เร็วกว่าถ้าไม่มีปัจจัยควบคุม (controlling factor)

ตัวอย่างของ negative control เช่นใน lac operon ซึ่งจะถูกควบคุมโดย lactose repressor โดยที่ lactose repressor จะไปจับที่ operator ของ lac operon ทำให้ขัดขวางการเข้ามาจับของ RNA polymerase ที่ promoter site ยับยั้ง transcription

  

2.2.3        Positive control

ในทางตรงกันข้ามกับ negative control มีบาง operon ที่สามารถทำงานได้เมื่อมีปัจจัยควบคุม (controlling factor) เรียกการทำงานแบบนี้ว่า positive operon control และใน lac operon ก็มีการควบคุมแบบนี้ (lac operon ถูกควบคุมได้ทั้ง  negative และ positive control)

positive control ของ lac  operon ควบคุมโดย catabolite activator protein (CAP) และ 3’,5’-cyclix adenosine monophosphate (CAMP) (fig 12.26) และ lac repressor protein ด้วย ที่ lac promoter มี CAP site (ให้ CAP มาจับ) ซึ่ง CAP จะต้องเข้ามาจับก่อนที่ RNA polymerase เข้ามาจับที่ promoter เพื่อทำการ transcription (fig 10-9) และการที่ cAMP- CAP ที่ CAP site จะทำให้งอสาย DNA เป็นมุม 90°                  หลังจากนั้น RNA polymerase จึงเข้ามาจับ ® ทำให้เกิดการ transcription 

การจับของ cAMP-CAP และ RNA polymerase ที่ lac control region นี้จะทำให้เกิดการกระตุ้นการจับของกันและกัน  ต่อสาย mRNA ให้แน่นขึ้น เรียกว่าเป็น cooperativity และถ้า CAMP-CAP หรือ RNA polymerase จับสาย mRNA เพียงตัวเดียวจะมี affinity การจับต่ำกว่าการจับพร้อมกัน

สรุปแล้วใน positive control ที่กระตุ้นการทำงานของ lac operon นั้นขึ้นอยู่กับ 2 ปัจจัยหลักคือ การมี cAMP และ lactose

2.2.4        Attenuation

·       Rho- dependent terminator พบใน l- phage (สังเคราะห์ Cro-DNA binding protein ที่เหี่ยวนำ lytic pathway

·       Rho-independent termination มี Rho-independent termination sites ซึ่งมี 2 ลักษณะคือ 1) poly U ตามหลัง 2) GC-rich self –complementary region ซึ่งสามารถฟอร์มเป็น stem-loop ซึ่งจะทำให้หยุดการทำงานของ RNA polymerase 

·       Premature termination by attenuation

ใน trp operon มี attenuator site ซึ่งอยู่ในตำแหน่ง down-stream จาก promoter – operator region ก่อน structural genes ของ trp operon เรียกว่าเป็น leader sequence (L)  มีความยาว 165 nucleotides จาก AUG start codon ของ E . coli gene (บน trp operon)

จากการศึกษาพบว่า E. coli ปกติ เมื่อมี tryptophan ในการเจริญจะมีการสังเคราะห์ leader RNA เท่านั้นส่วนที่เหลือของ trp operon จะไม่ถูก transcribed แต่พอเมื่อ tryptophan มีน้อยลง    ทั้ง leader sequence และ trp operon จะถูก transcribed       ทั้งนี้เกิดจากที่ trp leader RNA มี 4 regions ที่สามารถเกิดเป็น stem-loop structures และ 1ในจำนวนนี้ทำให้เกิด attenuation คือ

1.      high tryptophan ทำให้เกิดการฟอร์มของ the 3-4 stem-loop ที่ trp leader RNA ที่มี    poly U เป็นหาง ทำให้เกิดการ termination แบบ Rho-independent

2.      low trptophan เนื่องจากว่า region 1 ของ trp leader RNA มี tryptophan codons อยู่-หลาย codons      ดังนั้นเมื่อ E. coli ขาดกรดอะมิโน trptophan จึงทำให้ขาด       Trp– tRNA^Trp ที่จ่ายเข้ามาใน ribosome      ทำให้ ribosome หยุดที่ region 1 ของ trp leader RNA นี้

ในทางกลับกันถ้า tryptophan เพียงพอในเซลล์       ribosome จะเคลื่อนผ่าน region 1   ไป   region 2    เกิดการฟอร์ม 3-4 stem-loop       ดังนั้นจึงทำให้เกิดการฟอร์มของ 2-3 stem-loop ทำให้ region 3 ไม่สามารถ complement กับ region 4 ได้        และทำให้กระบวนการ transcription ของ trp operon เกิดขึ้นต่อทำให้สังเคราะห์ยีน EDCAB บน trp operon   เพื่อใช้สังเคราะห์ tryptophan ต่อไป  

___________________________________________________________________